Nội dung

Bài 16 Ức chế vi sinh vật bằng các tác nhân vật lý và hóa học Mặc dầu đa số vi sinh vật là có ích và cần thiết cho nhân loại, nhưng hoạt động của vi sinh vật cũng có thể gây nên nhiều tác hại cho con người. Chẳng hạn như việc gây nên các bệnh tật cho người, gia súc, gia cầm, việc làm hư hỏng thực phẩm, nguyên vật liệu... Vì vậy chúng ta phải nắm vững các phương pháp để tiêu diệt hoặc ức chế các vi sinh vật có hại, làm giảm bớt các thiệt hại do chúng gây nên. Chủ yếu là : (1) - Tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh và cản trở sự lan truyền của chúng. (2) - Giảm bớt hoặc hạn chế các vi sinh vật gây ô nhiễm nguồn nước, thực phẩm và phá hủy các nguyên vật liệu khác. Trong một thời kỳ rất dài, từ khi chưa biết đến sự tồn tại của vi sinh vật thì tổ tiên chúng ta đã biết không ít các biện pháp để tiêu độc và diệt khuẩn. Người Cổ Ai Cập đã biết dùng lửa để diệt khuẩn, dùng các chất tiêu độc để xử lý các vật thối rữa. Người Cổ Hy Lạp đã biết cách xông lưu huỳnh để bảo quản các vật liệu kiến trúc. Người Hê-Brơ (Hebrews) đã có luật thiêu hủy toàn bộ quần áo của những người bị bệnh hủi. Hiện nay, việc nắm vững các kỹ thuật tiêu diệt vi sinh vật vẫn hết sức quan trọng, chẳng hạn như việc sử dụng kỹ thuật vô khuẩn trong nghiên cưứ vi sinh vật, việc bảo quản lương thực, thực phẩm, việc phòng chống các bệnh truyền nhiễm... 15.1. ĐỊNH NGHĨA THUẬT NGỮ - Diệt khuẩn hay Khử trùng (sterilization): Từ gốc La Tinh sterilis là tuyệt dục, vô sinh. Có nghĩa là tiêu diệt tất cả vi sinh vật, bào tử, virus, viroid. Để diệt khuẩn có thể dùng các chất diệt khuẩn (sterilant) hoặc dùng các nhân tố vật lý khác. - Tiêu độc hay Khử độc (disinfection) là tiêu diệt, ức chế hoặc loại trừ các vi sinh vật gây bệnh.. Mục tiêu chủ yếu là tiêu diệt mầm bệnh nhưng trên thực tế cũng là làm giảm số lượng chung của vi sinh vật. Để tiêu độc cần dùng các chất tiêu độc (disinfectant). Đó thường là các hóa chất và thường dùng để tiêu độc các vật liệu không phải là cơ thể người và động thực vật. Các chất tiêu độc không diệt được bào tử và một số vi sinh vật, vì vậy không thể dùng để diệt khuẩn. -Tiêu độc vệ sinh (sanitization) có liên quan mật thiết với tiêu độc. Trong quá trình tiêu độc vệ sinh số lượng vi sinh vật giảm xuống tới từ mức an toàn trở xuống đối với sức khỏe công cộng, tức là đạt đến tiêu chuẩn vệ sinh. Các chất tiêu độc vệ sinh (sanitizer) thường được dùng để làm sạch môi trường và các vật dụng không phải cơ thể người và động thực vật. - Phòng thối (antisepsis) là dùng hóa chất để khống chế vi sinh vật sự sinh trưởng của vi sinh vật trên các tổ chức sinh vật (các mô). Gốc Hy Lạp , anti là đối kháng, sepsis là nhiễm trùng máu. Chất phòng thối (antiseptic) nhiều người gọi là chất sát trùng là chưa chính xác, dễ nhầm với chất diệt khuẩn (sterilant). Sử dụng chất phòng thối để phòng nhiễm khuẩn, mưng mủ nhờ tiêu diệt hay ức chế vi sinh vật gây bệnh, ngăn ngừa sự sinh trưởng của vi sinh vật trên các mô của sinh vật, giảm thiểu tổng số vi sinh vật. Độc tính của chất phòng thối thấp hơn chất tiêu độc là vì cần tránh việc làm chết quá nhiều tế bào của các mô. 1 - Chất kháng vi sinh vật (antimicrobial agent) được chia thành nhiều loại. Chất diệt khuẩn (germicide), gốc La Tinh cide là giết chết, là chất có thể tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh (pathogens). Như vậy tiếng Việt có hai chữ Chất diệt khuẩn để chỉ cả germicide lẫn sterilant. Thực chất các chất này cũng gần giống nhau, sterilant có phạm vi diệt khuẩn rộng hơn germicide. Các chất diệt nấm (fungicide), chất diệt tảo (algicide), chất diệt virus (viricide) để chỉ các chất tiêu diệt từng đối tượng riêng biệt. Có những hóa chất không làm chết được vi sinh vật nhưng có thể ức chế sự sinh trưởng của chúng. Có thể thường gặp các chất ức chế vi khuẩn (bacteriostatic), chất ức chế nấm (fungistatic), theo gốc Hy Lạp thì statikos là đình chỉ. Tất cả các chất nói trên thường định nghĩa dựa trên ảnh hưởng đối với các vi sinh vật gây hại. Có loại giết chết, có loại ức chế, nhưng trong hầu hết các trường hợp đều làm giảm tổng số vi sinh vật nói chung (không chỉ riêng đối với các vi sinh vật gây bệnh). 15.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP TIÊU DIỆT VI SINH VẬT Dưới tác dụng của một số nhân tố gây chết quần thể vi sinh vật không chết ngay toàn bộ. Giống như sự sinh trưởng của quần thể , sự chết của quần thể vi sinh vật thường xảy ra theo phương thức chỉ số (exponential) hay phương thức logarit (logarithmic). Có nghĩa là quần thể vi sinh vật sẽ giảm xuống tương ứng với khoảng cách thời gian. Bảng 15.1: Thí nghiệm giết vi sinh vật bằng nhiệt theo lý thuyết. (Theo sách của Prescott, Harley và Klein) Phút Số lượng vi sinh vật theo Số lượng vi sinh vật bị chết số phút trong 1 phút Log10 của số lượng vi sinh vật sống 1 106 9 x 105 5 2 105 9 x 104 4 3 4 3 3 2 4 5 10 9 x 10 3 9 x 10 2 2 9 x 10 1 1 10 10 6 10 9 0 7 1 0,9 -1 Lấy thời gian gây chết là trục hoành ta có được đường biểu thị là một đường thẳng. Sau khi giảm đa số vi sinh vật sống thì tốc độ chết của vi sinh vật cũng giảm. Đó là vì tính đề kháng khá cao của các vi sinh vật sống sót. 2 Để nghiên cứu hiệu lực của nhân tố gây chết phải xác định khi nào thì vi sinh vật chết. Đó là chuyện rất khó, vì khó xác định được đối với từng tế bào.Sau khi đưa vi khuẩn vào môi trường nuôi cấy trong điều kiện có thể sinh trưởng bình thường mà thấy chúng không sinh trưởng được thì chứng tỏ là chúng đã chết. Với virus nếu không cảm nhiễm được nữa vào vật chủ bình thưởng thì cũng chứng tỏ là đã chết. Hình 15.1: Phương thức chết của vi sinh vật (Theo sách của Prescott, Harley và Klein). Xử lý ở 121°C, trong ví dụ D 121 là trong 1 phút. 15.3. CÁC ĐIỀU KIỆN ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ CỦA CÁC NHÂN TỐ KHÁNG VI SINH VẬT Làm chết và ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật không đơn giản, bởi vì nhân tố kháng vi sinh vật (nhân tố làm chết hoặc ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật) là chịu ảnh hưởng của ít ra là 6 yếu tố sau đây: 1- Số lượng quần thể vi sinh vật: Vì trong mỗi khoảng cách thời gian số lượng vi sinh vật chết theo một cấp số bằng nhau, cho nên thời gian làm chết một lượng lớn vi sinh vật sẽ dài hơn so với một lượng nhỏ vi sinh vật. Có thể tham khảo số liệu ở bảng 15.1 và hình 15.1. Cùng nguyên lý như vậy đối với các nhân tố hóa học kháng vi sinh vật. 3 2- Thành phần quần thể vi sinh vật: các vi sinh vật khác nhau có tính mẫn cảm khác nhau với một nhân tố gây chết: Vì vậy cùng một nhân tố gây chết trong các tình huống khác nhau, với các loài vi sinh vật khác nhau thì hiệu quả tác dụng cũng rất khác nhau. Ví dụ, bào tử của vi sinh vật có tính đề kháng cao hơn rõ rệt so với các tế bào dinh dưỡng và các tế bào non. Một số loài vi sinh vật có tính chống chịu cao hơn so với các ảnh hưởng bất lợi của các loài khác. Ví dụ vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis gây bệnh lao có tính chống chịu với các nhân tố kháng vi sinh vật cao hơn so với các vi khuẩn khác. 3- Nồng độ và cường độ của một nhân tố kháng vi sinh vật: Thông thường (không phải mọi trường hợp) nồng độ càng cao của một nhân tố hóa học hay cường độ càng cao của một nhân tố vật lý làm cho tốc độ vi sinh vật chết càng nhanh. Nhưng hiệu suất của các nhân tố không phụ thuộc trực tiếp vào nồng độ và cường độ. Trong một phạm vi tương đối nhỏ thì một sự tăng nhỏ về nồng độ và cường độ có thể làm tăng hiệu ứng gây chết của nhân tố kháng vi sinh vật. Vượt qua khoảng xa hơn thì tiếp tục nâng cao nồng độ và cường độ không làm tăng tốc độ gây chết vi sinh vật. Có lúc, ở nồng độ thấp hơn lại có hiệu quả cao hơn, ví dụ cồn 70% có hiệu quả diệt khuẩn cao hơn cồn 95%, bởi vì hoạt tính của chúng được nâng cao khi có mặt của nước. Có tài liệu cho rằng với nồng độ cồn cao phần protein bên ngoài tế bào vi khuẩn sẽ ngưng tụ lại làm thành một vỏ bọc che chở cho vi khuẩn. 4- Thời gian tác dụng: Thời gian tác dụng của nhân tố kháng vi sinh vật càng dài thì số lượng vi sinh vật chết càng nhiều (hình 15.1). Để đạt đến mục đích diệt khuẩn thì thời gian tác dụng phải đủ để cho tỷ lệ sống sót chỉ còn 10-6 hoặc thấp hơn nữa. 5- Nhiệt độ: Tăng nhiệt có thể làm tăng hiệu quả hoạt tính của hóa chất. Thông thường với một nồng độ thấp của chất tiêu độc (disinfectant) hay nhân tố diệt khuẩn cần xử lý ở nhiệt độ cao hơn. 6- Môi trường bên ngoài vi sinh vật: Việc khống chế quần thể vi sinh vật không tách rời mà gắn với các nhân tố môi trường, hoặc làm tăng hay làm giảm tác động gây chết. Ví dụ trong điều kiện acid, nhiệt độ có hiệu quả diệt khuẩn cao hơn, do đó đối với các đồ uống có tính acid như nước quả, nước cà chua thì dễ diệt khuẩn theo kiểu Pasteur (pasteurise) hơn so với các thực phẩm có pH cao hơn như là sữa chẳng hạn. Nhân tố môi trường quan trọng thứ hai là một số chất hữu cơ có thể bảo vệ vi sinh vật đề kháng với tác dụng của nhiệt độ hay của các chất tiêu độc hóa học. Màng sinh học (biofilm) là một ví dụ rất rõ. Các chất hữu cơ trên bề mặt của màng sinh học sẽ bảo vệ các vi sinh vật tạo thành màng sinh học, cho nên màng sinh học và các vi sinh vật trong đó rất khó trừ khử. Vì vậy trước khi diệt khuẩn hay tiêu độc một 4 số vật phẩm trước hết cần rửa sạch. Đối với ống tiêm và các dụng cụ y khoa hay nha khoa trước khi diệt khuẩn cần phải rửa sạch để tránh sự có mặt quá nhiều chất hữu cơ giúp bảo vệ cho mầm bệnh và làm tăng nguy cơ nhiễm khuẩn. Khi chế tạo nước uống cũng cần chú ý là nguồn nước thành phố vẫn còn chứa khá nhiều chất hữu cơ cho nên cần dùng nhiều chlorine mới đủ sức tiêu độc 15.4. SỬ DỤNG CÁC PHƯƠNG PHÁP VẬT LÝ ĐỂ KHỐNG CHẾ VI SINH VẬT Tăng nhiệt và việc dùng các phương pháp vật lý khác thường được dùng để diệt khuẩn. Các phòng thí nghiệm vi sinh vật đều dùng các nồi hấp áp suất cao (autoclave) để diệt khuẩn. Tăng nhiệt, qua lọc, chiếu tia tử ngoại, dùng bức xạ điện ly là 4 phương pháp vật lý thường được sử dụng. 15.4.1. Tăng nhiệt Người Cổ Hy Lạp đã biết dùng lửa hay đun nước sôi để diệt khuẩn hay tiêu độc. Tăng nhiệt đến nay vẫn là phương pháp thường dùng nhất để diệt khuẩn. Chủ yếu có phương pháp dùng sức nóng ẩm và sức nóng khô. Sức nóng ẩm dễ dàng gây chết virus, vi khuẩn và nấm (bảng 15.2). Trong nước sôi sau 10 phút có thể làm chết các tế bào dinh dưỡng và bào tử của các vi sinh vật có nhân thực. Nhưng nhiệt độ sôi (100°C) không đủ sức làm chết nội bào tử của vi khuẩn. Bào tử vi khuẩn có thể tồn tại vài giờ trong nước sôi. Do đó cách đun sôi chỉ dùng để đun nước uống hoặc để tiêu độc các vật phẩm không bị phá hủy trong nước sôi, không thể dùng để diệt khuẩn. Bảng 15.2: Điều kiện ước chừng để diệt khuẩn bằng sức nóng ẩm Vi sinh vật Tế bào dinh dưỡng Bào tử Nấm men 5 min., 50-60°C 5 min., 7080°C Nấm sợi 30 min., 62°C 30 min., 80°C 10 min., 60-70°C 2-trên 800 min., 100°C 0,5-12 min, 121°C Vi khuẩn 5 Virus 30 min., 60°C (Theo sách của Prescott, Harley và Klein) Vì tăng nhiệt là biện pháp rất quan trọng để khống chế vi sinh vật cho nên cần có một tiêu chuẩn chính xác đối với hiệu suất diệt khuẩn bằng sức nóng (heat-killing efficiency). Trước đây dùng điểm gây chết do nhiệt (thermal death point, TDP). Đó là nhiệt độ thấp nhất đủ để diệt hết vi sinh vật trong dịch huyền phù (suspention) sau 10 phút. Nhưng vì vi sinh vật chết theo phương thức logarit, cho nên trên lý thuyết không có thể tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật trong một mẫu vật, tức là phải kéo dài thời gian tăng nhiệt. Vì vậy có một phương thức biểu thị chính xác hơn và đã được tiếp nhận rộng rãi, đó là Thời gian giảm thiểu thập phân (decimal reduction time, D) hoặc gọi là Trị số D (D value). Trị số D là thời gian cần thiết để diệt hết 90% vi sinh vật hoặc bào tử trong một mẫu vật ở một nhiệt độ nhất định. Trên một đồ thị bán logarit (semilogarithmic plot) thấy rõ số lượng vi sinh vật biến đổi theo thời gian tăng nhiệt (hình 15.2). Trị số D là thời gian cần thiết để số lượng vi sinh vật giảm 10 lần. Trị số D liên quan đến tính đề kháng của vi sinh vật đối với các nhiệt độ khác nhau. Từ trị số D mà tính ra trị số Z (Z value). Trị số Z là nhiệt độ tăng lên đủ để làm giảm 1/10 trị số D. Một cách biểu thị khác là trị số F (F value) đó là thời gian cần thiết (tính bằng min.) đủ để diệt hết một quần thể tế bào hoặc bào tử ở một nhiệt độ nhất định (thường là 121°C). Hình 15.2: Tính toán trị số Z 6 Căn cứ vào trị số D ở các nhiệt độ khác nhau để tính ra trị số Z. Trị số Z có thể dùng để tính toán mối quan hệ giữa nhiệt độ và thời gian sống sót của vi sinh vật. Trị số Z là số nhiệt độ tăng đủ để làm giảm 10% trị số D. Trong đồ thị này trị số Z là 10,50C. Trị số D biểu thị bằng thang logarit. (Theo sách của Prescott, Harley và Klein). Trị số D và trị số Z được ứng dụng rộng rãi trông công nghiệp chế biến thực phẩm. Khi sản xuất đồ hộp cần xử lý nhiệt sau khi đưa thực phẩm vào hộp và hàn hộp lại. Cần xử lý nhiệt để đủ mức diệt được vi khuẩn gây ngộ độc thịt Clostridium botulinum. Vi khuẩn này gây ra độc tố botulism rất nguy hiểm. Xử lý nhiệt độ đủ dài để làm cho số lượng bào tử của vi khuẩn này nếu có từ 1012 giảm xuống chỉ còn 1 bào tử (10°). Trị số D đối với bào tử vi khuẩn này ở 121°C là 0,204 min., vì vậy để tiêu diệt 1012 bào tử xuống còn 1 bào tử cần 12D hay 2,5 phút. Trị số Z đối với Clostridium botulinum là 10°C - tức là tăng 10°C thì giảm được 10 lần trị số D. Nếu diệt khuẩn ở 111°C thì trị số D phải tăng 10 lần, tức là 2,04 phút và trị số 12D tăng lên đến 24,5 phút . Bảng 15.3 nêu lên trị số D và trị số Z của một số vi khuẩn thường gặp trong thực phẩm. Bảng 15.3: Trị số D và trị số Z của một số vi khuẩn gây bệnh gặp trong thực phẩm Vi sinh vật Cơ chất D(°C),phút Z (°C) Clostridium botulinum Đệm phosphat D121=0,204 10 Cl.perfringens (chủng kháng nhiệt) MT nuôi cấy D90=3-5 6-8 Salmonella Sản phẩm gà D60=0,39-0,40 4,9-5,1 Staphylococcus aureus Sản phẩm gà SP gà tây Dung dịch NạCl 0,5% D60=5,17-5,37 D60=15,4 D60=2,0-2,5 5,2-5,8 6,8 5,6 (Theo sách của Prescott,Harley và Klein) Có 3 số liệu đối với tụ cầu vàng (S.aureus), cho thấy tốc độ làm chết vi khuẩn này thay đổi phụ thuộc vào môi trường và hiệu quả bảo vệ của chất hữu cơ. Với sức nóng ẩm phải cần nhiệt độ cao hơn 100°C thì mới có thể diệt được nội bào tử (endospores) của vi khuẩn, và cần có áp suất cao trong điều kiện bão hòa hới nước. Thiết bị diệt khuẩn thường dùng được gọi là autoclave (hình 15.3) 7 Hình 15.3: Hai loại autoclave nhỏ và lớn Về cơ bản autoclave cũng tương tự như nồi hầm chịu áp lực vẫn thường dùng trong gia đình. Tùy yêu cầu mà có cái dùng lửa, có cái dùng điện, có cái dùng hơi nước chuyển vào, có cái nhỏ, có cái vừa, có cái lớn hoặc rất lớn. Autoclave do nhà khoa học Chamberland phát minh ra vào năm 1884 và phát minh này đã thúc đẩy sự phát triển của Vi sinh vật học. Autoclave phải có van để đẩy hết không khí ra và trong nồi chỉ còn có hơi nước bão hòa. Có thể đóng van ngay từ đầu đợi áp lực nâng lên một ít rồi mới mở van để loại hết không khí ra. Cũng có thể mở van ngay từ đầu, khi thấy hới nước bay ra nhiều mới đóng van lại. Thường diệt khuẩn ở 121°C (áp suất 15 pounds) trong 15 phút. Có thể diệt hết mọi tế bào vi sinh vật và bào tử. Diệt khuẩn bằng sức nóng ẩm thông qua việc phá hủy acid nucleic, làm biến tính enzym và các protein khác, đồng thời còn có thể phá vỡ màng tế bào mà làm chết vi sinh vật. Diệt khuẩn bằng sức nóng ẩm phải tiến hành triệt để mới có hiệu quả. Khi chưa loại bỏ hết không khí thì ở áp suất 15 pounds nhiệt độ không thể đạt đến 121°C. Các vật cần xử lý không nên xếp chật quá cản trở việc tiếp xúc với hơi nước nóng. Lúc diệt khuẩn một bình có thể tích lớn thì phải giữ thời gian dài hơn, để làm cho toàn bộ dịch thể phải đạt tới 121°C. Chẳng hạn khi diệt khuẩn ở bình 5 lít thì phải xử lý trong 70 phút. Để khắc phục các nhân tố nói trên người ta thường xếp kèm với sinh vật chỉ thị khi diệt khuẩn các vật phẩm. Khi đó dùng ống (ampule) chứa môi trường dinh dưỡng vô khuẩn có thêm mảnh giấy có tẩm bào tử vi khuẩn Bacillus stearothermophilus hay Clostridium. sp PA3679. Diệt khuẩn xong phá vỡ ống trong điều kiện vô khuẩn và nuôi cấy vài ngày. Nếu sinh vật chỉ thi không sinh trưởng thì là việc diệt khuẩn đã thành công. 8 Người ta thường xử lý nhiệt ở độ sôi đối với sữa và nhiều chất khác. Phương pháp này gọi là phương pháp khử trùng Pasteur (Pasteurization) để kỷ niệm phát minh này của ông. Vào thập kỷ 60 của thế kỷ 19 do rượu vang bị nhiễm khuẩn, gây khó khăn cho việc bảo quản và vận chuyển, gây khó khăn cho việc sản xuất rượu vang ở Pháp. Pasteur đã dùng kính hiển vi quan sát thấy các trong rượu bị ô nhiễm có mặt các vi khuẩn lên men lactic và acetic. Ông thấy xử lý ở nhiệt độ 55-60°C có thể làm chết các vi sinh vật này và có thể bảo quản tương đối lâu dài rượu vang. Năm 1886 hai nhà hóa học Đức là V.H. Soxhlet và F.Soxhlet sử dụng kỹ thuật này để bảo quản sữa và làm giảm việc sữa lây truyền mầm bệnh. Năm 1889 phương pháp tiêu độc Pasteur với sữa được nhập vào Hoa Kỳ và người ta đã dùng phương pháp này để xử lý sữa, bia, và nhiều loại bđồ uống khác. Phương pháp tiêu độc Pasteur không đạt tới mục đích diệt khuẩn nhưng đủ làm chết các vi khuẩn gây bệnh, giảm mạnh các vi khuẩn không gây bệnh nhưng làm hư hỏng thực phẩm và làm chậm rõ rệt tốc độ biến chất của thực phẩm. Có thể có hai phương pháp khử trùng sữa. Phương pháp tương đối cổ là xử lý ở 63 °C trong 30 phút. Còn phương pháp hiện thường được sử dụng là phương pháp khử trùng ngắn (flash Pasteurization), còn gọi là phương pháp khử trùng ngắn ở nhiệt độ cao (hightemperature short-term, HTST), tức là xử lý ở 72°C chỉ trong 15 giây, sau đó nhanh chóng làm lạnh. Trong công nghiệp thực phẩm có lúc cũng còn dùng phương pháp khử trùng siêu nhiệt (ultrrahigh temperature, UHT), tức là xử lý sữa và các sản phẩm sữa ở nhiệt độ 140-150°C chỉ trong 1-3 giây. Sữa xử lý siêu nhiệt không cần bảo quản lạnh, có thể bảo quản hai tháng an toàn ở nhiệt độ phòng. Các gói cà phê kem (coffee creamer) cung cấp ở khách sạn thường được diệt khuẩn theo phương pháp này. Nhiều vật phẩm có thể diệt khuẩn bằng sức nóng khô (dry heat sterilization). Đưa các vật phẩm này vào tủ sấy và giữ nhiệt độ 160-170°C trong 2-3 giờ. Vi sinh vật bị chết do bị oxy hóa các thành phần tế bào, và làm biến tính protein. Mặc dầu diệt khuẩn bằng sức nóng khô không có hiệu quả cao như bằng sức nóng ẩm. Bào tử của vi khuẩn Clostridium botulinum bị chết ở 121°C sau 5 phút khi dùng sức nóng ẩm nhưng chỉ bị chết như vậy ở 160°C sau 2 giờ. Diệt khuẩn bằng sức nóng khô có những ưu thế riêng vì không làm ăn mòn các vật liệu thủy tinh và kim loại như sức nóng ẩm, có thể dùng để xử lý các dạng bột, dầu và các chất tương tự. Hầu hết các phòng thí nghiệm xửn lý hộp Petri và các pipét bằng sức nóng khô. Không thích hợp sử dụng phương pháp này để xử lý các vật phẩm bằng chất dẻo và cao su. 9 Hình 15.4: Tủ sấy nhiệt độ khô 15.4.2. Nhiệt độ thấp Nhiệt độ thấp được sử dụng để ức chế sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Đây là phương pháp quan trọng ngành vi sinh vật học thực phẩm. Ở nhiệt độ -20°C hay thấp hơn, vật phẩm bị đông lạnh, vi sinh vật bị đình chỉ sinh trưởng. Một số vi sinh vật bị chết vì các tinh thể băng là phá vỡ màng tế bào,.nhưng lạnh sâu không làm chết phần lớn các vi sinh vật nhiễm trên vật phẩm. Trên thực tế nhiều phòng thí nghiệm dùng các tủ lạnh sâu -30°C hay -70°C để bảo quản vi sinh vật. Vì thực phẩm đông lạnh có thể chứa nhiều vi sinh vật, cho nên khi làm tan băng phải xử lý ngay để tiêu thụ, tránh để tổn hại và để cho các vi sinh vật gây bện phát triển. Bảo quản lạnh giúp làm chậm sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, nhưng không đủ làm ngừng hẳn sự sinh trưởng. Đáng mừng là phần lớn các vi sinh vật gây bệnh là thuộc loại ưa ấm (mesophilic) và không sinh trưởng được ở nhiệt độ 4°C. Các vật giữ lạnh bị hư hỏng bởi các vi khuẩn ưa lạnh (psychrophilic) và chịu lạnh (psychrotrophic) nhất là khi có tồn tại nước, các tủ lạnh chỉ dùng để bảo quản ngắn hạn thực phẩm và các vật phẩm khác. 15.4.3. Qua lọc Phương pháp qua lọc là phương pháp rất tốt để giảm thấp quần thể vi sinh vật đối với các vật liệu mẫn cảm với nhiệt độ và nhiều khi có thể dùng để diệt khuẩn các dung dịch. Qua lọc chỉ đơn giản là loại vi sinh vật khỏi dung dịch chứ không phải là diệt khuẩn. Có hai loại lọc vi sinh vật. Thiết bị qua lọc tầng sâu (depth filter): đó là loại thiết bị cấu tạo bởi sợi hay các vật chất dạng hạt, tạo thành một bản lọc khá dầy với những lỗ rất nhỏ. Dưới sức hút chân không dung dịch sẽ được lọc qua còn vi sinh vật bị giữ lại hay bị hấp phụ (adsorption) trên bề mặt bản lọc. Nguyên liệu để làm ra bản lọc này thường là đất Tảo silic (dimatomaceous earth) - đó là thiết bị lọc Berkefield. Còn có thể dùng một loại sứ (unglazed porcelain) - đó là thiết bị lọc Chamberlain. Hoặc còn có thể dùng thạch miên (asbestos) hay các nguyên liệu khác. Gần đây người ta dùng thiết bị màng lọc (membrane filters) thay thế cho thiết bị qua lọc tầng sâu. Màng lọc hình tròn, dày khoảng 0,1mm và được chế tạo bởi acetate cellulose, nitrate cellulose, polycarbonate, fluoride polyvinylidene hay các chất tổng hợp khác. Các màng lọc có lỗ với đường kính khoảng 0,2μm là có thể dùng để lọc bỏ phần lớn các tế bào dinh dưỡng của vi sinh vật, trừ virus. Dịch lọc thường chỉ từ 1ml đến vài lít. Màng lọc được lắp cố định trên một giá đặc biệt (hình 15.5) Dưới áp lực của máy hút chân không dịch lọc được chuyển sang một bình vô khuẩn. Loại thiết bị màng lọc này được dùng trong ngành dược, lọc thuốc đau mắt, chuẩn bị các môi trường nuôi cấy, các loại dầu, chất kháng sinh và nhiều vật chất kém chịu nhiệt khác. 10 Hình 15.5: Thiết bị màng lọc 1. Bình Erlenmeyer đựng dịch cần lọc 2. Dịch lọc được đẩy sang thiết bị màng lọc nhờ máy bơm 3. Thiết bị màng lọc (với các loại hình các kích cỡ khác nhau). Phương pháp diệt khuẩn nhờ lọc còn dùng để lọc không khí. Hai ví dụ thường gặp là khẩu trang dùng trong ngoại khoa và nút bông dùng cho các ống nghiệm hay các bình nuôi cấy vi sinh vật. Không khí đi qua được nhưng vi sinh vật thì bị giữ lại bên ngoài. Phòng cấy Laminar thoáng khí nhưng an toàn sinh học (Laminar flow biological safety cabinet) đã sử dụng màng lọc không khí bằng các hạt hiệu lực cao HEPA (high-efficiency particulate filter). Nó có thể lọc được đến 99,97% các hạt có kích thước 0,3μm và được coi là một hệ thống lọc rất quan trọng. Người nuôi cấy vi sinh vật có thể thao tác thoải mái trong một phòng cấy mở một phần cửa nhưng rất an toàn nhờ luôn có một luồng không khí vô khuẩn được thổi từ phía trong và lại thoát ra qua màng lọc HEPA đặt ở phía trên. Khi thao tác với các vi sinh vật nguy hiểm như vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis, virus gây ung thư, các ADN tái tổ hợp... nhất thiết cần sử dụng phòng cấy này. Thiết bị này được dùng trong các phòng thí nghiệm, trong công nghiệp, như là công nghiệp dược phẩm, để chuẩn bị môi trường, thao tác thí nghiệm, nuôi cấy mô… 11 Hình 15.6: Phòng cấy Laminar 15.4.4. Bức xạ (radiation) Bức xạ tử ngoại (Ultraviolet radiation-UV) với bước sóng 260nm có hiệu ứng diệt khuẩn rất mạnh, tuy nhiên không có khả năng xuyên qua thủy tinh, các màng bẩn, nước và một số cơ chất khác. Vì vậy UV chỉ dùng để diệt khuẩn trong một số trường hợp, ví dụ diệt khuẩn không khí trong tủ cấy, phòng nuôi cấy hoặc bền ngoài một số vật thể. UV có hại đối với da và mắt cho nên phải tắt đèn UV trước khi vào làm việc nơi có đèn này. UV cũng có thể dùng để diệt khuẩn nước, phải là một tầng nước mỏng đi qua đèn UV để đủ sức diệt mầm bệnh và các vi sinh vật khác.. Bức xạ ion hóa (ionizing radiation) hay bức xạ điện ly có sức xuyên rất mạnh và được dùng rất tốt để diệt khuẩn. Nó có thể diệt cả tế bào dinh dưỡng lẫn bào tử vi khuẩn, cả vi sinh vật nhân nguyên thủy (procaryotic) lẫn các vi sinh vật có nhân thật (eucaryotic). Tia gamma từ nguồn cobalt 60 được dùng để diệt khuẩn nguội đối với chất kháng sinh, kích tố (hormones), chỉ khâu vết thương, các vật liệu y học bằng chất dẻo (plastic) như ống tiêm... Tia gamma còn được diệt khuẩn và tiêu độc (pasteurize) đối với thịt và các thực phẩm khác. Bức xạ ion hóa có thể diệt các vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm như Escherichia coli O157:H7, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni... Cả cơ quan quản lý thực phẩm và thuốc Hoa Kỳ (FDA) lẫn tổ chức Y tế thế giới (WHO) đều xác định tính an toàn của việc chiếu xạ này đối với thực phẩm. Đã có một nhà máy chiếu xạ thương phẩm ở gần Tampa (bang Florida). Tiếc rằng phương pháp này chưa được ứng dụng rộng rãi tại Hoa Kỳ, nguyên nhân là do giá còn cao và nhiều người còn lo ngại các ảnh hưởng bất lợi của việc chiếu xạ lên thực phẩm. Gần đây, Chính phủ Mỹ đã phê chuẩn việc chiếu xạ lên thịt gia cầm, thịt bò, thịt lợn, thịt bê, thịt cừu non, hoa quả, rau củ và các chất điều vị. Việc chiếu xạ trong tương lai sẽ ngày càng được ứng dụng rộng rãi. 12 15.5. SỬ DỤNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC ĐỂ KHỐNG CHẾ VI SINH VẬT Mặc dầu người ta vẫn thường dùng các phương pháp vật lý để tiêu độc nhưng các tác nhân hóa học cũng thường được dùng để tiêu độc (disinfection) và phòng thối (antisepsis). Có nhiều nhân tố ảnh hưởng đếnhiệu quả tiêu độc và phòng thối bằng phương pháp hóa học. Chẳng hạn như loài vi snh vật, nồng độ và bản chất của các chất tiêu độc và phòng thối, thời gian xử lý,... Trước khi sử dụng các chất tiêu độc hay phòng thối thì bề mặt vật thể phải được làm sạch. Cần đảm bảo sự an toàn khi dùng hóa chất trong các phòng thí nghiệm hay trong bệnh viện. Hóa chất cũng được dùng để phòng chống sự sinh gtrưởng của vi sinh vật trong thực phẩm. Có nhiều loại hóa chất được dùng làm chất tiêu độc, mỗi loại đều có những ưu điểm và nhược điểm riêng. Trước khi chọn sử dụng hóa chất nào phải hiểu rõ đặc tính của chất đó. Trong trường hợp pha rất loãng và có mặt chất hữu cơ thì chất đó vẫn có thể tác dụng có hiệu quả lên các nhân tố truyền nhiễm (vi khuẩn Gram dương, Gram âm, vi khuẩn kháng acid, nội bào tử của vi khuẩn, các loại nấm và virus...), mặt khác lại phải không có hại đối với cơ thể người, không làm ăn mòn các vật phẩm nói chung. Trong thực tiễn, rất khó đạt đến tiêu chuẩn vừa có hiệu lực vừa ít độc đối với cơ thể. Một số hóa chất tuy hiệu lực thấp nhưng vì khá vô hại nên vẫn được sử dụng. Chất tiêu độc phải ổn định khi bảo quản, không có mùi vị khó chịu, tan trong nước và trong dầu để dễ xâm nhập vào vi sinh vật và phải có sức căng bề mặt thấp để xâm nhập được vào các khe trên bề mặt. Nếu giá không cao càng tốt. Một vấn đề nghiêm trọng là việc sử dụng quá mức Triclosan và các chất diệt khuẩn (germicides) khác. Chất kháng khuẩn (antibacterial) này hiện thấy có mặt trong các sản phẩm như chất khử mùi (deodorant), nước súc miệng, xà phòng, thớt cắt rau, đồ chơi trẻ em... Triclosan hầu như đang có mặt khắp nơi, hậu quả là đã xuất hiện các vi khuẩn kháng Triclosan. Ví dụ trực khuẩn mủ xanh Pseudomonas aeruginosa đã có thể bài xuát chất này ra khỏi tế bào. Tương tự như trường hợp vi khuẩn phản ứng với việc dùng quá độ thuốc kháng sinh, vi khuẩn cũng sẽ có sự đáp ứng như vậy khi dùng quá mức các chất phòng thối. Hiện đã có bằng chứng cho thấy việc sử dụng rộng rãi Triclosan đã làm tăng tần số xuất hiện các vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh. Vì vậy việc dùng quá mức các chất phòng thối (antiseptic) có khả năng sinh ra những hậu quả khó lường. Bảng 15.4: Nồng độ sử dụng và mức độ hoạt tính của các chất diệt khuẩn thông dụng Hóa chất Nồng độ sử dụng Mức độ hoạt tính* 450-500mg/L Cao Glutaraldehyde dich thể 2% Tương đối cao Formaldehyde + cồn 8 + 70% Cao H2O2 ổn định 6-30% Tương đối cao Formaldehyde dịch thể 6-8% Tương đối cao Dạng khí: Ethylene oxide Dạng lỏng: 13 Iodophors 750-5000mg/L Tương đối cao Iodophors 75-159mg/L Tương đối thấp Iodine + cồn 0,5 + 70% Trung bình Hợp chất của Chlore 0,1-0,5% Trung bình Hợp chất của phenol,dịch thể 0,5-3% Tương đối thấp Iodine, dich thể 1% Trung bình Cồn (ethyl, isopropyl) 70% Trung bình Hợp chất Ammon bậc 4 0,1-0,2% trong nước Thấp Chlorohexidine 0,75-4% Thấp Hexachlorophene 1-3% Thấp Hợp chất Thủy ngân 0,1-0,2% Thấp *Hoạt tính cao-có thể làm chết vi khuẩn kể cả vi khuẩn lao, bào tử, nấm, virus; Hoạt tính trung bình- làm chết mọi vi khuẩn, trừ bào tử; Hoạt tính thấp- làm chết tế bào dinh dưỡng của vi khuẩn, trừ VK lao, làm chết nấm, virus có lượng lipid mức trung bình. Theo Symour S. Block, 1983. 14 Hình 15.7: Cấu trúc của một số chất tiêu độc và chất phòng thối thông dụng Loại Phenol Phenol là chất phòng thối và tiêu độc được sử dụng rộng rãi đầu tiên. Năm 1867 Joseph Lister đã dùng phenol để làm giảm nguy hiểm của việc nhiễm vi sinh vật trong quá trtình phẫu thuật. Hiện nay phenol và các dẫn xuất như các loại cresol, các loại xylenol và orthophenylphenol đã được dùng để làm chất tiêu độc trong các phòng thí nghiệm và bệnh viện. Chất tiêu độc thương mại Lysol là một hợp chất loại phenol. Các chất loại phenol có tjhể làm biến tính protein và phá hủy màng tế bào. Chúng có ưu điểm là có thể diệt vi khuẩn lao khi có mặt các chất hữu cơ. Sau khi sử dụng có thể duy trì tác dụng khá lâu trên bề mặt vật thể. Nhưng chúng có mùi khó chịu và có thể làm kích thích da. Hexachlorophene là một chất phòng thối thường dùng vì có thể làm giảm số lượng vi khuẩn trên da và duy trì được khá lâu, nhưng nó lại có thể làm tổn thương não cho nên hiện chỉ dùng trong bệnh viện khi có sự bộc phát của Tụ cầu khuẩn Staphylococcus. 15 Cồn Cồn là một trong những loại thuốc tiêu độc và thuốc phòng thối thường dùng. Cồn có thể làm chết cả vi khuẩn và nấm nhưng không làm chết được bào tử. Một số virút chứa lipid cũng bị cồn làm chết. Ethanol và Isopopanol là hai loại cồn thường dùng để diệt khuẩn, nồng độ thường dùng là 70-80%, nồng độ này làm biến tính protein, còn có thể làm hòa tan màng lipid. Để diệt khuẩn nhiệt kế và các dụng cụ nhỏ cần xử lý bằng cồn trong 10-15 phút. Các Halogens Halogen là một trong 5 nguyên tố thuôc nhóm VIIA của bảng tuần hoàn (Fluorin-F, Chlorine-Cl, Bromine-Br, Iodine-I và Astatine-). Ở trạng thái tự do các phân tử tồn tại dưới dạng 2 nguyên tử liên kết với nhau. Cúng có thể tạo thành muối với sodium (Na) hay các kim loại khác. I và Cl là hai loại kháng vi sinh vật quan trọng. I thường được dùng làm thuốc phòng thối (antiseptic) ngoài da. Nó làm chết vi sinh vật do oxy hóa các thành phần tế bào, iod hóa (iodinating) các protein. Với nồng độ cao có thể làm chết bào tử, nói chung là sử dụng tinture d’iode (tinture of iodine) - tức là IK với nồng độ 2 % hay cao hơn iodine trong dung dịch nước-ethanol. Mặc dầu I là chất phòng thối có hiệu quả nhưng cũng có thể làm tổn thương da, có thể làm biến màu da, còn có thể gây dị ứng (allergie). Gần đây người ta sử dụng iodophore - hợp chất của I với một chất hữu cơ. Iodophore tan trong nước, không làm bẩn màu da, có thể giải phóng dần Iodine nên giảm tổn hại và giảm kích thích da. Loại tiêu độc da và dùng trong phòng thí nghiệm phổ biến là loại có nhãn hiệu là Wescodyne, còn loại tiêu độc vết thương thường dùng loại có nhẫn hiệu là Betadine. Iodine thường được dùng để tiêu độc nước tiêu dùng tại thành thị và các bể bơi. Cũng được dùng trông công nghiệp sữa, công nghiệp thực phẩm. Có thể dùng khí chlorine, sodium hypochlorite hoặc calcium hypochlorite. Khi sử dụng chúng biến thành HClO rồi giải phóng nguyên tử oxy: Sẽ xảy ra sự oxy hóa các tế bào dinh dưỡng của vi khuẩn, nâm nhưng không có tác dụng với bào tử: Cl2 + H2O→ HCl + HClO Ca(OCl)2 + 2H2O → Ca (OH)2 + 2 HClO HClO → HCl + O Dưới tác dụng của chúng hầu như tất cả vi sinh vật sẽ bị giết chết trong vòng 30 phút. Vì phản ứng của chất hữu cơ với tác động của Cl và các dẫn xuất của Cl nên đã can thiệp vào tác dụng diệt khuẩn của Cl cho nên người ta thường sử dụng quá lượng Cl để bảo đảm hiệu quả diệt khuẩn. Có một khả năng là Cl phản ứng với chất hữu cơ hình thành nên những hợp chất gây ung thư trihalomethanes, cho nên trong nước uống cần phải kiểm tra sự tồn tại của chất này. Tại Châu Âu và Canada 16 đôi khi người ta sử dụng thành công ozone để thay thế cho việc chlorine hóa (chlorination). Cl là một chất tiêu độc tốt, khống đắt, lại dễ dàng sử dụng nên rất hay được sử dụng. Với một lượng nước uống nhỏ có thể tiêu độc bằng những viên halozone. Halozone (acid parasulfone dichloramidobenzoic) sau khi đưa vào nước sẽ từ từ giải phóng ra chloride, sau khoảng nửa giờ có thể đạt tới mục đích tiêu độc. Chất này thường được sử dụng trong trường hợp thiếu nước sạch để uống. Dung dịch Cl là chất tiêu độc có hiệu quả trong gia đình và trong các phòng thí nghiệm. Có thể dùng nồng độ pha loãng 100 lần dịch tẩy trắng gia dụng (household bleach) phối hợp với chất tẩy không ion hóa (non ionic detergent) sao cho nồng độ chất tẩy vào khoảng 0,8%. Hỗn hợp này vừa làm sạch vừa loại bỏ vi khuẩn Các Kim loại nặng Trong nhiều năm các ion kim loại nặng như Hg, Ag, As, Zn và Cu thường được dùng để làm chất diệt khuẩn (germicides). Nhiềug kim loại nặng có tác dụng ức chế vi sinh vật (bacteriostatic) hơn là diệt khuẩn. Hiện các chất này đã được thay thế bằng các chất khác có độc tính thấp hơn và có hiệu quả hơn. Nhưng cũng có thường hợp ngoại lệ, ví dụ dung dịch 1% AgNO3 thường được dùng làm thuốc nhỏ mắt để phòng bệnh lậu ở mắt (trong nhiều bệnh viện người ta dùng Erythromycin để thay thế nitrat bạc vì chất kháng sinh này có hiệu quả chống cả Chlamydia lẫn Neisseria. Bạc sulfadiazine thường được dùng trong điều trị bỏng. CuSO4 thường được dùng để diệt tảo có hiệu quả trong ao hồ và các bể bơi. Kim loại nặng kết hợp với protein , làm bất hoạt protein và cũng có thể làm kết tủa protein của tế bào. Các muối ammon bậc bốn (Quaternary Ammonium Compounds) Các chất tẩy (Detergents - từ gốc La Tinh detergere có nghĩa là loại trừ) là những phân tử hữu cơ được dùng làm các chất giữ âm (wetting agents) và nhũ hóa (emulsifiers) vì chúng vừa có cực thân nước (polar hydrophilic) vừa có những gốc phi cực kỵ nước (nonpolar hydrophobic ends). Chúng có thể làm tan các chất khó hòa tan bởi các phương pháp khác, vì vậy dùng làm chất tẩy rửa, giặt giũ rất có hiệu quả, nhưng cơ chế khác với các chất béo có trong xà phòng. 17 Mặc dầu các chất tẩy dạng ion có chức năng kháng vi sinh vật nhất định nhưng chỉ có các chất tẩy rửa cationic (ion dương) mới có tác dụng tiêu độc. Thường dùng nhất là các muối ammon bậc bốn, chúng làm phá vỡ màng tế bào, cũng có thể làm biến tính protein. Các chất tẩy cationic như Benzalkonium chloride và Cetylpyridinium chloride có thể giết chết phần lớn vi khuẩn nhưng không giết được vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis và các nội bào tử. Chúng có ưu điểm là ổn định, không độc và không gây kích thích... nhưng lại bị mất tác dụng trong nước cứng (hard water) và nước xà phòng. Các chất tẩy cationic thường được dùng để làm chất tiêu độc đối với bát đĩa, các thiết bị nhỏ và để xử lý ngoài da. Zephiran có chứa benzalkonium chloride và Ceepryn có chứa cetylpyridinium, chloride là các mặt hàng thường gặp trên thị trường. Các Aldehyde Hai loại aldehyde thường được sử dụng là Formaldehyde và Glutaraldehyde. Chúng có phản ứng rất mạnh, có thể kết hợp với acid nucleic và protein và làm bất hoạt chúng, còn có thể làm bất hoạt thông qua việc liên kết chéo (crosslinking) và alkyl hóa (alkylating). Chúng có thể làm chết bào tử, có thể dùng làm chất diệt khuẩn hóa học. Formaldehyde thường được dùng dưới dạng hòa tan trong nước hay trong cồn. Dung dịch đệm 2% glutaraldehyde là một loại chất tiêu độc có hiệu quả và thường được dùng để tiêu độc các phòng thí nghiệm và bệnh viện. Glutaraldehyd trong 10 phút đã đủ để tiêu độc nhưng để giết chết bào tử cần tới 12 giờ. Các khí diệt khuẩn Có nhiều vật phẩm không chịu được nhiệt độ cao như các đĩa Petri bằng chất dẻo, các ống tiêm nhựa, các bộ phận của máy tim-phổi nhân tạo, các ống dẫn, ống nói... cần diệt khuẩn bằng khío ethylene oxide (EtO). EtO có thể kết hợp với protein, có thể làm chết cả vi sinh vật lẫn bào tử. EtO nhanh chóng xuyên qua được các bao bì bằng chất dẻo nên là một loại chất tiêu độc đặc biệt hiệu quả. Tiêu độc bằng EtO rất giống với tiêu độc trong nồi cao áp. Cần khống chế nồng độc EtO, nhiệt độ và độ ẩm. Với EtO thuần khiết thường dùng nồng độ 10-20% phối hợp với CO2 hay dichlorodifluorromethane. Với các vật dụng sạch cần xử lý ở 38°C trong 5-8 giờ, nếu ở 54°C cần xử lý trong 3-4 giờ. Nồng độ EtO là là 700mg/lít.Vì EtO có độc tính lớn cho nên sau khi tiêu độc cần thổi khí mạnh để loại trừ hết EtO đi. 18 Betapropiolactone (BPL) cũng là loại khí dùng để tiêu độc. Trong trạng thái lỏng BBL dùng để tiêu độc văcxin và huyết thanh. BBL sẽ bị phá hủy thàn dạng vô hoạt tính sau vài giờ chứ không khó loại trừ như EtO. Năng lực diệt khuẩn tuy cao hơn EtO nhưng khả năng xuyên thấu qua vật liệu lại kém hơn so với EtO. Hơn nữa chất này có thể gây ung thư cho nên không được ứng dụng rộng rãi như EtO. Gần đây hydrogen peroxide dạng bay hơi cũng được dùng để tiêu độc các phòng thao tác an toàn sinh học. 15.6. ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC CỦA CÁC TÁC NHÂN KHÁNG VI SINH VẬT Tại Hoa Kỳ việc đánh giá các tác nhân kháng vi sinh vật được thực hiện bởi hai cơ quan khác nhau: Cơ quan quản lý các chất tiêu độc bảo vệ môi trường và Cơ quan quản lý Thực phẩm và dược phẩm. Cần đánh giá các tác nhân này có hiệu quả kháng vi sinh vật hay không, có hiệu lực từ nồng độ nào. Sau đó tiến hành trên từng ứng dụng thực tiễn. Phổ biến nhất là Thí nghiệm Hệ số phenol (phenol coefficient test), tức là so sánh hiệu lực của một số chất tiêu độc với phenol. Đầu tiên pha loãng với các mức độ khác nhau, sau đó cấy vào các độ pha loãng này vi khuẩn thương hàn Salmonella typhi và tụ cầu vàng Staphylococcus aureus, để ở 20°C hay 37°C. Sau 5 phút lại cấy sang môi trường mới và nuôi cấy tiếp 2 ngày hay lâu hơn. Độ pha loãng cao nhất trong 10 phút có thể diệt hết vi khuẩn được dùng để tính toán Hệ số phenol. Lấy bội số pha loãng của chất thử nghiệm chia cho bội sô pha loãng phenol đạt hiệu quả như nhau thì thu được Hệ số phenol. Ví dụ bội số pha loãng của phenol là 90 mà bội số pha loãng của chất tiêu độc thử nghiệm là 450 thì Hệ số phenol là 5. Hệ số phenol càng cao thì biểu thị chất thử nghiêm có nang lực tiêu độc trong cùng điều kiện thí nghiệm càng cao. Hệ số phenol càng cao hơn 1 thì biểu thị năng lực tiêu độc càng cao hơn phenol (bảng 15.5) Bảng 15.5: Hệ số phenol của một số chât tiêu độc Chất tiêu độc Với S.typhi* Với S.aureus* Phenol 1 1 Cetylpyridinium chloride 228 337 O-phenylphenol 5,6 (20°C) 4,0 19 p-cresol 2,0-2,3 2,3 Hexachlorophene 5-15 15-40 Merthiolate 600 62,5 Mercurochrome 2,7 5,3 Lysol 1,9 3,5 Isopropyl alcohol 0,6 0,5 Etanol 0,04 0,04 Dung dich 2%I2 trong 4,1-5,2 cồn 4,1-5,2 *Những chỗ không chú thích là xử lý ở 37°C Hệ số phenol là có ích để sơ bộ lựa chọn chất tiêu độc, nhưng trong quá trình ứng dụng thực tế không thể dùng để biểu thị hiệu lực cao thấp của chất tiêu độc. Bởi vì hệ số phenol là số liệu thu được trong những điều kiện thí nghiệm nhất định, với các vi sinh vật thuần chủng, còn trong thực tế với một quần thể vi sinh vật phức tạp, có tồn tại các chất hữu cơ, chất vô cơ, với các pH, nhiệt độ khác nhau..., hiệu lực của chất tiêu độc chịu ảnh hưởng rất nhiều vào các nhân tố môi trường khi sử dụng. Muốn đánh giá thực tế hơn hiệu lực của các chất tiêu độc có thể tiến hành các phương pháp thử nghiệm khác. Trên thực tế so sánh các chất hóa học khác nhau để kiểm tra tốc độ diệt khuẩn. Có thể dùng Thử nghiệm pha loãng thực dụng (use dilution test) để tiến hành xác định. Tìm nồng độ nào của chất tiêu độc có thể diệt được 95% vi sinh vật theo mức độ tin cậy. Còn có thể dùng phương pháp Thí nghiệm thực dụng (in-use test) trong các điều kiện thực tế cụ thể để xác định nồng độ bắt đầu có tác dụng của từng chất tiêu độc. 20 Bài 17 Khái niệm chung về trao đổi chất ở Vi sinh vật 16.1. NĂNG LƯỢNG 16.1.1. Năng lượng và công Có thể định nghĩa một cách đơn giản nhất năng lượng là khả năng tạo nên công hoặc gây nên những biến đổi đặc biệt. Do đó, tất cả các quá trình lý, hoá là kết quả của việc sử dụng hoặc vận động của năng lượng. Tế bào sống thực hiện ba loại công chủ yếu, tất cả đều cần thiết cho các quá trình sống.   Công hoá học, bao gồm việc tổng hợp các phân tử sinh học phức tạp từ các tiền chất đơn giản hơn. Năng lượng ở đây được dùng để nâng cao tính phức tạp phân tử của tế bào. Công vận chuyển, cần năng lượng để hấp thu các chất dinh dưỡng, loại bỏ các chất thải và duy trì các cân bằng ion. Như ta biết, nhiều phân tử chất dinh dưỡng bên ngoài môi trường phải đi vào tế bào mặc dù nồng độ nội bào của các chất này thường cao hơn ngoại bào nghĩa là ngược với gradien điện hoá. Với các chất thải và các chất độc hại cần phải được loại bỏ khỏi tế bào, tình hình cũng diễn ra tương tự.  Công cơ học, có lẽ là loại công quen thuộc nhất trong ba loại công. Năng lượng ở đây cần cho việc thay đổi vị trí vật lý của các cơ thể, các tế bào và các cấu trúc bên trong tế bào. Hầu hết năng lượng sinh học bắt nguồn từ ánh sáng mặt trời khả kiến chiếu lên bề mặt trái đất. Quang năng được hấp thu bởi các sinh vật quang dưỡng trong quá trình quang hợp nhờ chất diệp lục và các sắc tố khác sau đó chuyển thành hoá năng. Trái với sinh vật quang dưỡng, nhiều vi khuẩn hoá tự dưỡng vô cơ (chemolithoautotrophs) lại thu được năng lượng nhờ oxy hoá các chất vô cơ. Hoá năng từ quang hợp và hoá dưỡng vô cơ sau đó có thể được các sinh vật quang tự dưỡng vô cơ và hoá tự dưỡng vô cơ sử dụng để chuyển CO2 thành các phân tử sinh học như Glucose (Hình 16.1).  21 Hình 16.1: Dòng carbon và năng lượng trong một hệ sinh thái (Theo: Prescott và cs, 2005) Các phân tử phức tạp do các cơ thể tự dưỡng tổng hợp (cả thực vật và vi sinh vật) được dùng làm nguồn carbon cho các sinh vật hoá dị dưỡng và các sinh vật tiêu thụ khác vốn sử dụng các phân tử hữu cơ phức tạp làm nguồn vật chất và năng lượng để xây dựng nên các cấu trúc tế bào của riêng mình (trên thực tế các sinh vật tự dưỡng cũng sử dụng các phân tử hữu cơ phức tạp). Các sinh vật hoá dị dưỡng thường sử dụng O2 làm chất nhận electron khi oxy hoá Glucose và các phân tử hữu cơ khác thành CO2. Trong quá trình này - được gọi là hô hấp hiếu khí - O2 đóng vai trò là chất nhận electron cuối cùng và bị khử thành nước. Quá trình trên giải phóng ra nhiều năng lượng. Do đó trong hệ sinh thái năng lượng được hấp thu bởi các cơ thể quang tự dưỡng và hoá tự dưỡng vô cơ. Sau đó, một phần năng lượng này được chuyền cho các cơ thể hoá dị dưỡng khi chúng sử dụng các chất dinh dưỡng bắt nguồn từ bọn tự dưỡng (Hình 16.1). CO2 tạo thành trong hô hấp hiếu khí có thể lại được lắp vào các phân tử hữu cơ phức tạp trong quang hợp và hoá tự dưỡng vô cơ. Rõ ràng, dòng carbon và năng lượng trong hệ sinh thái có liên quan mật thiết với nhau. Các tế bào phải vận chuyển năng lượng một cách có hiệu quả từ bộ máy sản xuất năng lượng tới các hệ thống thực hiện công. Nghĩa là, chúng cần có một đồng tiền chung về năng lượng để tiêu dùng, đó là Adenosine 5’- triPhosphate tức ATP (hình 16.2). Hình 16.2. Adenosine triPhosphate và Adenosine diPhosphate. 22 (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005) Hình 16.3: Chu trình năng lượng của tế bào. Khi ATP phân giải thành Adenosine diPhosphate (ADP) và ortoPhosphate (Pi) năng lượng giải phóng ra sẽ được dùng để thực hiện công hữu ích. Sau đó, năng lượng từ quang hợp, hô hấp hiếu khí, hô hấp kỵ khí và lên men lại được dùng để tái tổng hợp ATP từ ADP và Pi trong chu trình năng lượng của tế bào (Hình 16.3). ATP được tạo thành từ năng lượng cung cấp bởi hô hấp hiếu khí, hô hấp kị khí, lên men và quang hợp. Sự phân giải của ATP thành ADP và Phosphate (Pi) giúp cho việc sản ra công hóa học, công vận chuyển và công cơ học. 16.1.2. Các định luật về nhiệt động học Để hiểu được năng lượng tạo thành ra sao và ATP hoạt động như thế nào với vai trò là đồng tiền năng lượng ta cần nắm được một số nguyên lý cơ bản của nhiệt động học. Nhiệt động học phân tích những thay đổi về năng lượng trong một tổ hợp vật thể (ví dụ: một tế bào hay một cây) được gọi là một hệ thống. Mọi vật thể khác trong tự nhiên được gọi là môi trường xung quanh. Nhiệt động học tập trung vào sự sai khác năng lượng giữa trạng thái ban đầu và trạng thái cuối cùng của một hệ thống mà không quan tâm đến tốc độ của quá trình. Chẳng hạn, nếu một xoong nước được đun đến sôi thì, về nhiệt động học, chỉ điều kiện nước lúc ban đầu và khi sôi là quan trọng, còn việc nước được đun nhanh chậm ra sao và được đun trên loại bếp lò nào thì không cần chú ý. Trong nhiệt động học không thể không đề cập đến hai định luật quan trọng sau đây. Theo định luật thứ nhất, năng lượng không thể được tạo ra hoặc mất đi. Tổng năng lượng trong tự nhiên là hằng số mặc dù có thể được phân bố lại. Chẳng hạn, trong các phản ứng hoá học, thường diễn ra sự trao đổi năng lượng (Ví dụ, nhiệt được thoát ra ở các phản ứng ngoại nhiệt và được hấp thu trong các phản ứng nội nhiệt) nhưng những sự trao đổi nhiệt này không trái với định luật trên. 23 Để xác định lượng nhiệt được sử dụng trong hoặc thoát ra từ một phản ứng nào đó người ta dùng hai loại đơn vị năng lượng: một calo (cal) là lượng nhiệt năng cần để tăng nhiệt độ của một gam nước từ 14,5 đến 15,50C. Lượng nhiệt cũng có thể được biểu hiện bằng joule (joule, J) là đơn vị của công. 1 cal của nhiệt tương đương với 4,1840 J của công. 1000 cal hay 1 kilocalo (kcal) là lượng nhiệt đủ đun sôi khoảng 1,9ml nước. 1 kilojoule (kj) là lượng nhiệt đủ đun sôi khoảng 0,44 ml nước hoặc giúp cho một người nặng 70 kg leo lên được 35 bậc. Joule thường được các nhà hoá học và vật lý học sử dụng, còn các nhà sinh học lại quen sử dụng calo khi nói về năng lượng. Vì vậy, calo cũng được sử dụng ở đây khi những sự thay đổi năng lượng được đề cập. Mặc dù năng lượng được bảo tồn trong tự nhiên nhưng định luật thứ nhất của nhiệt động học không giải thích được nhiều quá trình vật lý và hoá học. Hãy lấy một ví dụ đơn giản để làm sáng tỏ điều nói trên. Hình 16.4: Sự bành trướng của khí từ xylanh chứa đầy khí sang xylanh rỗng khí. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005) Giả dụ, ta nối một xylanh đầy khí với một xylanh rỗng khí bằng bằng một ống chứa 1 van (Hình 16.4). Nếu ta mở van khí sẽ từ xylanh đầy tràn sang xylanh rỗng cho đến khi khí áp cân bằng ở 2 xylanh. Năng lượng không chỉ được phân bố lại, nhưng cũng được bảo tồn. Sự bành trướng của khí được giải thích bằng định luật thứ hai của nhiệt động học và một trạng thái vật chất được gọi là entropi. Có thể xem entropi là đại lượng đo tính hỗn độn hoặc mất trật tự của một hệ thống. Tính hỗn độn của một hệ thống càng lớn thì entropi của hệ thống cũng càng lớn. Định luật thứ hai nói rằng các quá trình vật lý và hoá học diễn ra theo cách sao cho tính hỗn độn hoặc mất trật tự của cả hệ thống và môi trường xung quanh tăng tới cực đại có thể. Khí bao giờ cũng sẽ bành trướng sang xylanh trống. 16.1.3. Năng lượng tự do và các phản ứng Các định luật thứ nhất và thứ hai có thể kết hợp trong một phương trình chung liên kết những thay đổi trong năng lượng có thể diễn ra trong các phản ứng hoá học và các quá trình khác. 24 ∆G = ∆H - T.∆S ∆G là sự thay đổi trong năng lượng tự do, ∆H là sự thay đổi trong entalpi (enthalpi).T là nhiệt độ Kelvin (0C + 273) và ∆S là sự thay đổi trong entropi (entropy) diễn ra trong phản ứng. Sự thay đổi trong entalpi là sự thay đổi trong nhiệt lượng. Các phản ứng trong tế bào diễn ra ở điều kiện áp suất và thể tích không thay đổi. Do đó sự thay đổi trong entalpi sẽ tương tự như sự thay đổi trong năng lượng tổng cộng trong phản ứng. Sự thay đổi năng lượng tự do là nhiệt lượng trong một hệ thống có khả năng sinh công ở nhiệt độ và áp suất không thay đổi. Vì vậy, sự thay đổi trong entropi là đại lượng đo tỉ lệ của sự thay đổi năng lượng tổng cộng mà hệ thống không thể sử dụng để thực hiện công. Sự thay đổi của năng lượng tự do và của entropi không phụ thuộc vào việc hệ thống diễn ra như thế nào từ lúc bắt đầu tới khi kết thúc. Ở nhiệt độ và áp suất không đổi một phản ứng sẽ xảy ra ngẫu nhiên nếu năng lượng tự do của hệ thống giảm đi trong phản ứng, hay nói theo cách khác, nếu ∆G là âm. Từ phương trình trên suy ra là một phản ứng với sự thay đổi lớn, dương tính trong entropi sẽ thường có xu hướng có giá trị ∆G âm và vì vậy xảy ra ngẫu nhiên. Một sự giảm trong entropi sẽ có xu hướng làm cho ∆G dương tính hơn và phản ứng ít thuận lợi. Hình 16.5: ∆Go’ và cân bằng. Quan hệ của ∆Go’ với sự cân bằng của các phản ứng. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005) Sự thay đổi trong năng lượng tự do có quan hệ xác định, cụ thể đối với hướng của các phản ứng hoá học. Ta hãy xét phản ứng đơn giản sau đây: A+B C+D Nếu được hỗn hợp các phân tử A và B sẽ kết hợp với nhau tạo thành các sản phẩm C và D. Cuối cùng C và D sẽ trở nên đậm đặc đủ để kết hợp với nhau và tạo thành A và B với cùng tốc độ như khi chúng được tạo thành từ A và B. Phản ứng bây giờ ở trạng thái cân bằng: tốc độ theo hai hướng là như nhau và không có sự thay đổi rõ rệt nào diễn ra trong nồng độ của các chất phản ứng và các sản phẩm. Tình hình trên được mô tả là hằng số cân bằng (Keq) liên kết nồng độ cân bằng của các sản phẩm và cơ chất với nhau: 25 Nếu hằng số cân bằng lớn hơn 1 các sản phẩm sẽ có nồng độ lớn hơn các chất phản ứng và phản ứng có xu hướng diễn ra đến cùng (Hình 16.5). Hằng số cân bằng của một phản ứng liên quan trực tiếp với sự thay đổi trong năng lượng tự do của phản ứng. Khi được xác định ở các điều kiện tiêu chuẩn quy định chặt chẽ về nồng độ, áp suất, pH và nhiệt độ thì sự thay đổi năng lượng tự do cho một quá trình được gọi là sự thay đổi năng lượng tự do tiêu chuẩn (∆Go). Nếu giữ ở pH 7,0 (gần với pH của tế bào sống) sự thay đổi năng lượng tự do tiêu chuẩn sẽ được chỉ bởi ký hiệu ∆Go’. Sự thay đồi trong năng lượng tự do tiêu chuẩn có thể được xem là lượng năng lượng cực đại mà hệ thống có thể thực hiện công hữu ích ở các điều kiện tiêu chuẩn. Việc sử dụng các giá trị ∆Go’ cho phép ta so sánh các phản ứng mà không cần quan tâm tới những thay đổi trong ∆G, do những sai khác trong các điều kiện môi trường. Quan hệ giữa ∆Go’ và Keq được thể hiện qua quá trình sau: ∆Go’ = -2,303RTlgKeq. R là hằng số khí (1,9872 cal/mol hoặc 8,3145 J/mol) và T là nhiệt độ tuyệt đối. Từ phương trình trên rút ra khi ∆Go’ âm hằng số cân bằng sẽ lớn hơn 1, phản ứng sẽ diễn ra đến cùng và được gọi là phản ứng thoát nhiệt (Hình 16.5). Trong một phản ứng thu nhiệt ∆Go’ là dương và hằng số cân bằng nhỏ hơn 1. Điều đó có nghĩa là phản ứng không thuận lợi và ít sản phẩm được tạo thành ở các điều kiện tiêu chuẩn. Cần nhớ rằng giá trị ∆Go’ chỉ cho ta biết phản ứng nằm ở đâu khi cân bằng chứ không nói lên phản ứng đạt được cân bằng nhanh chậm ra sao. 16.1.4. Vai trò của ATP trong trao đổi chất Nhiều phản ứng trong tế bào là thu nhiệt, khó diễn ra hoàn toàn nếu không có sự giúp đỡ từ bên ngoài. Một trong các vai trò của ATP là hướng các phản ứng nói trên xảy ra được triệt để hơn. ATP là một phân tử cao năng nghĩa là nó có thể bị thuỷ phân hầu như hoàn toàn thành ADP và Pi với một ∆Go’ khoảng -7,3kcal/mol. ATP + H2O ADP + Pi Với ATP thuật ngữ phân tử cao năng không có nghĩa là một lượng lớn năng lượng được dự trữ bên trong một liên kết đặc biệt của ATP mà chỉ đơn giản chỉ ra rằng việc loại bỏ nhánh Phosphate tận cùng diễn ra với sự thay đổi năng lượng tự do chuẩn là âm, lớn hoặc phản ứng là thoát nhiệt mạnh. Nói cách khác ATP có thế mạnh chuyền nhóm Phosphate và dễ dàng chuyền Phosphate cho nước. Thế chuyền nhóm Phosphate được quy định là âm của ∆Go’ đối với việc loại bỏ thuỷ phân Phosphate. Một phân tử có thế chuyền nhóm cao hơn sẽ chuyển Phosphate cho phân tử có thế thấp hơn. 26 Như vậy ATP thích hợp khá lý tưởng đối với vai trò là đồng tiền năng lượng. ATP được tạo thành trong các quá trình hấp thu và sản sinh năng lượng như quang hợp, lên men và hô hấp hiếu khí. Đứng về kinh tế của tế bào sự phân giải ATP thải nhiệt liên kết với các phản ứng thu nhiệt khác nhau giúp cho các phản ứng này được hoàn thành (Hình 16.6). Nói cách khác ATP liên kết các phản ứng sinh năng lượng với các phản ứng sử dụng năng lượng. 16.1.5. Các phản ứng oxy hoá - khử và các chất mang electron Sự thay đổi năng lượng tự do không chỉ liên quan tới cân bằng của các phản ứng hoá học thông thường mà còn tới cân bằng của các phản ứng oxy hoá-khử. Việc giải phóng năng lượng thường bao gồm các phản ứng oxy hoá-khử là các phản ứng trong đó các electron được chuyển từ chất cho (hoặc chất khử) tới chất nhận electron (hoặc chất oxy hoá). Theo quy ước một phản ứng như vậy sẽ được viết với chất cho nằm ở phía bên phải của chất nhận cùng với số (n) electron (e-) được chuyển: Chất nhận + ne- Chất cho Hình 16.6. ATP như một tác nhân liên kết Việc sử dụng ATP để tạo thành các phản ứng nội năng là thuận lợi hơn. ATP được tạo thành bởi các phản ứng ngoại năng, sau đó được dùng để hướng dẫn các phản ứng nội năng. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005) Cặp chất nhận và chất cho được gọi là cặp redox (Bảng 16.1). Khi một chất nhận nhận các electron nó sẽ trở thành chất cho của cặp. Hằng số cân bằng đối với phản ứng được gọi là thế khử chuẩn (Eo) và là đại lượng đo xu hướng mất electron của chất khử. Tiêu chuẩn tham khảo dùng cho các thế khử là hệ thống hydro với 27 (thế khử ở pH 7,0) là -0,42V hoặc -420mV. 2H+ + 2e- H2 Trong phản ứng này mỗi nguyên tử hydrogen cung cấp một proton (H+) và một electron (e-). Thế khử có ý nghĩa cụ thể. Các cặp redox với thế khử âm hơn sẽ chuyền electron cho các cặp với thế khử dương hơn và ái lực lớn hơn đối với các electron. Do đó các electron sẽ có xu hướng di chuyển từ các chất khử ở chóp của bảng 16.1 đến các chất oxy hoá ở đáy vì chúng có thế dương hơn. Bằng mắt thường, điều này có thể được thể hiện ở dạng của một tháp electron trong đó các thế khử âm nhất là ở chóp (hình 16.7). Bảng 16.1: Các cặp oxy hóa - khử chọn lọc quan trọng về sinh học. (Theo: Prescott và cs, 2005) E’o (Volt)a Cặp oxy hóa khử 2H+ + 2e- H2 - 0,42 Ferredoxin(Fe3+) + e- Ferredoxin (Fe2+) - 0,42 NAD(P)+ + H+ + 2e- NADP(H) - 0,32 S + 2H+ + 2e- H2S Acetaldehyd + 2H+ + 2e- + Pyruvate + 2H + 2e + - - FAD + 2H + 2e - 0,274 Ethanol Lactate Malate2- Fumarate2- + 2H+ + 2e- Succinate2- Ubiquinone + 2H+ + 2e- - 0,185 FADH2 Oxaloacetat2- + 2H+ + 2e- Cytochrome b (Fe3+) + e- - 0,197 2- Cytochrome b (Fe2-) Ubiquinone H2 - 0,18b - 0,166 0,031 0,075 0,10 28 Cytochrome c (Fe3+) + e- Cytochrome c (Fe2+) 0,254 NO3- + 2H+ + 2e- NO2- + H2O 0,421 NO2- + 8H+ + 6e- NH4+ + 2H2O 0,44 Fe3+ + e- Fe2+ + O2 + 4H + 4e - 2H2O 0,771 0,815 a/ là thế khử chuẩn ở pH 7,0 b/ Giá trị đối với FAD/FADH2 ứng dụng cho cofactor tự do vì nó có thể thay đổi đáng kể khi liên kết với 1 apoenzyme c/ Giá trị đối với Fe tự do không phải Fe gắn với protein (ví dụ các Cytochrome). Các electron di chuyển từ các chất cho tới các chất nhận xuôi theo gradien điện thế hoặc rơi xuống tháp đến các điện thế dương hơn. Ta hãy xem trường hợp của chất mang electron NAD+ (nicotinamide adenine - dinucleotide). Cặp NAD+/NADH có rất âm, và vì vậy có thể cho electron tới nhiều chất nhận kể cả O2. Hình 16.7. Sự di chuyển của electron và các thế khử. 29 Tháp electron thẳng đứng có các thế khử âm nhất ở đỉnh. Các electron chuyển dịch ngẫu nhiên từ các chất cho cao hơn trên tháp (các thế hiệu âm hơn) tới các chất nhận thấp hơn trên tháp (các thế hiệu dương hơn). Nghĩa là, chất cho trên tháp bao giờ cũng cao hơn chất nhận. Chẳng hạn NADH sẽ chuyền các electron tới oxy và tạo thành nước trong quá trình. Một số chất cho và chất nhận điển hình được ghi ở bên trái và thế oxy hóa khử của chúng được cho trong ngoặc đơn. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005) NAD+ + 2H+ + 2eO2 + 2H+ + 2e- NADH + H+ = -0,32V H2O = +0,82V Vì NAD+/NADH âm hơn O2/H2O các electron sẽ di chưyển từ NADH (chất khử) tới O2 (chất oxy hoá) như ở hình 16.7. NADH + H+ + O2 H2O + NAD+ Khi các electron di chuyển từ một chất khử tới một chất nhận với một thế oxy hoá khử dương hơn năng lượng tự do sẽ được giải phóng. ∆Go’ của phản ứng liên quan trực tiếp tới mức độ sai khác giữa thế khử của hai cặp (∆E’o). ∆E’o càng lớn thì năng lượng tự do thoát ra cũng càng lớn như chỉ ra bởi phương trình sau: ∆G’o= -nF∆E’o. Ở đây n là số electron được chuyển và F là hằng số Faraday (23,062 cal/mol-von hoặc 96,494 J/mol-von). Với mỗi thay đổi 0,1V trong ∆ sẽ có sự thay đổi 4,6 kcal tương ứng trong ∆ và Keq trong các phản ứng hoá học khác nghĩa là hằng số cân bằng càng lớn thì ∆ cũng càng lớn. Sự khác nhau trong thế khử giữa NAD+/NADH và O2/H2O là 1,14V, một giá trị ∆ lớn. Trong hô hấp hiếu khí khi các electron di chuyển từ NADH tới O2 một lượng lớn năng lượng tự do được dùng để tổng hợp ATP (Hình 16.8) NADH + H+ + 1/2O2 NAD+ + H2O ∆ = 52,6 kcal.mol-1 Khi các electron di chuyển từ các thế khử âm đến các thế khử dương năng lượng sẽ được giải phóng; trái lại, khi các electron di chuyển từ các điện thế dương hơn đến các điện thế âm hơn năng lượng sẽ cần để đẩy các electron theo hướng ngược lại như diễn ra trong quang hợp (Hình 16.8), ở đây quang năng được thu nhận và được dùng để đẩy các electron từ nước tới chất mang electron nicotinamide dinucleotide Phosphate (NADP+). Như hình 16.1 đã chỉ dẫn các sinh vật quang hợp thu nhận và sử dụng quang năng để vận chuyển các electron từ nước (và các chất cho electron khác như H2S) đến các chất nhận electron như NADP+ có các thế khử âm hơn. Sau đó các electron này có thể di chuyển trở lại tới các chất nhận dương hơn và cung cấp năng lượng để tạo thành ATP trong quang hợp. Các cơ thể quang tự dưỡng sử dụng ATP và NADPH để tổng hợp các phân tử phức tạp từ CO2. Các sinh vật hóa dị dưỡng cũng sử dụng năng lượng giải phóng ra trong sự vận chuyển của các electron nhờ sự oxy hoá các chất dinh dưỡng phức tạp trong hô hấp để tạo thành NADH. Sau đó NADH chuyền các electron cho O2 và năng lượng thoát ra trong sự vận chuyển electron được giữ lại ở dạng ATP. Năng lượng từ ánh 30 sáng mặt trời được sử dụng bởi tất cả các sinh vật chính vì mối quan hệ này giữa dòng electron và năng lượng. Hình 16.8: Dòng năng luợng trong trao đổi chất Những ví dụ của mối quan hệ giữa dòng electron và năng luợng trong trao đổi chất. Oxy và NADP+ được dùng làm chất nhận electron lần lượt từ NADH và nước. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005) Hình 16.9: Cấu trúc và chức năng của NAD+. (a) Cấu trúc của NAD và NADP. NADP khác với NAD ở chỗ có thêm 1 Phosphate trên một trong các đường ribose; (b) NAD có thể nhận các electron và 1 hydro từ cơ chất khử (SH2). Các electron và hydro này được mang trên vòng nicotinamide. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005) 31 Sự vận chuyển electron có ý nghĩa quan trọng trong hô hấp hiếu khí, hô hấp kỵ khí, hoá dưỡng vô cơ và quang hợp. Sự vận chuyển electron trong tế bào cần sự tham gia của các chất mang như NAD+ và NADP+, cả hai chất này đều có thể vận chuyển electron giữa các vị trí khác nhau. Vòng nicotinamide của NAD+ và NADP+ (Hình 16.9) tiếp nhận hai electron này và một proton từ một chất cho, còn proton thứ hai được tách ra. Hình 16.10: Cấu trúc và chức năng của FAD Vitamin riboflavin bao gồm vòng isoalloxazine và đường ribose gắn vào. FMN là riboflavin Phosphate. Phần của vòng trực tiếp tham gia vào các phản ứng oxy hóa khử là phần có màu. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005) Một số chất mang electron khác có vai trò trong trao đổi chất của vi sinh vật cũng được nêu trong bảng 16.1; các chất này mang electron theo các cách khác nhau. Flavinadenine dinucleotide (NAD) và flavin-mononucleotide (FMN) mang 2 electron và 2 proton trên hệ thống vòng phức tạp (Hình 16.10). Các protein chứa FAD và FMN thường được gọi là flavoprotein. Coenzyme Q (CoQ) hoặc Ubiquinone là một quinon vận chuyển các electron và các H+ trong nhiều chuỗi vận chuyển electron hô hấp (Hình 16.11). Các cytochrome và một số chất mang khác sử dụng các nguyên tử sắt để vận chuyển electron qua các phản ứng oxy hoá - khử thuận nghịch: Fe3+ (sắt ferric) Fe2+ (sắt ferrous) Trong cytochrome các nguyên tử sắt này là một phần của nhóm hem (Hình 16.12) hoặc của các vòng sắt - porphyrin tương tự khác. 32 Hình 16.11. Cấu trúc và chức năng của Coenzyme Q hoặc Ubiquinone Chiều dài của chuỗi bên thay đổi tùy theo cơ thể với n = 6 đến n = 10. (Theo Prescott và cs, 2005) Các chuỗi vận chuyển electron hô hấp thường chứa cytochrome bao gồm một protein và một vòng sắt - porphyrin. Một số protein mang electron chứa sắt thiếu nhóm hem và được gọi là các protein sắt không - hem. Ferredoxin (Fd) là một protein sắt không-hem hoạt động trong việc vận chuyển electron quang hợp và một số quá trình vận chuyển electron khác. Mặc dù nguyên tử sắt ở chúng không gắn với nhóm hem nhưng chúng vẫn thực hiện được các phản ứng oxy hoá. Cần chú ý rằng trong số các phân tử tham gia vào chuỗi vận chuyển electron nói trên, ở mỗi thời điểm, một số mang hai electron (như NAD, FAD và CoQ), số khác (như các cytochrome và các protein sắt không-hem) chỉ mang một electron. Sự khác nhau trong số lượng electron được vận chuyển có ý nghĩa rất quan trọng trong hoạt động của các chuỗi vận chuyển electron. 33 Hình 16.12: Cấu trúc của Hem Hem bao gồm 1 vòng porphyrin gắn với 1 nguyên tử sắt. Đây là thành phần khôngprotein của nhiều Cytochrome . Nguyên tử sắt luân phiên tiếp nhận và giải phóng 1 electron. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005) 16.2. ENZYME Như đã nói ở trên một phản ứng thoát nhiệt là một phản ứng có ∆Go’ âm và hằng số cân bằng lớn hơn 1 và có thể diễn ra triệt để nghĩa là về phía bên phải của phương trình. Tuy nhiên, người ta thường có thể hỗn hợp các chất phản ứng của một phản ứng thoát nhiệt mà không thấy kết quả rõ ràng mặc dù các sản phẩm có thể được tạo thành. Chính enzyme đóng vai trò trong các phản ứng này. 16.2.1. Cấu trúc và phân loại các enzyme Enzyme là các chất xúc tác có bản chất protein, có tính đặc hiệu cao đối với phản ứng xúc tác và với các phân tử chịu xúc tác. Chất xúc tác là một chất làm tăng tốc độ của một phản ứng hoá học mà bản thân không bị thay đổi. Do đó enzyme thúc đẩy các phản ứng của tế bào. Các phân tử phản ứng được gọi là cơ chất và các chất tạo thành được gọi là sản phẩm. Nhiều enzyme là các protein thuần khiết, nhưng cũng không ít enzyme gồm hai thành phần: thành phần protein (gọi là apoenzyme) và phần không - protein (gọi là cofactor); cả hai cần cho hoạt tính xúc tác và enzyme gồm cả hai thành phần trên được gọi là holoenzyme. Cofactor được gọi là nhóm thêm (prosthetic group) nếu gắn chặt vào apoenzyme. Nhưng thường thì cofactor gắn lỏng lẻo với apoenzyme, thậm chí có thể phân li khỏi protein enzyme sau khi các sản phẩm đã được tạo thành và mang một trong các sản phẩm này đến một enzyme khác. Cofactor gắn lỏng lẻo nói trên được gọi là 34 coenzyme. Chẳng hạn, NAD+ là một coenzyme mang các electron bên trong tế bào. Nhiều vitamin mà con người cần đóng vai trò là các coenzyme hoặc là tiền chất (precursor) của các coenzyme. Niacin được lắp vào NAD+ và riboflavin được lắp vào FAD. Các ion kim loại cũng có thể liên kết với các apoenzyme và tác dụng như các cofactor. Mặc dù tế bào chứa một số lượng lớn và rất đa dạng các enzyme nhưng chúng có thể được xếp vào một trong 6 nhóm (Bảng 16.2). Tên của các enzyme thường được đặt theo tên cơ chất mà chúng tác dụng lên và loại phản ứng được xúc tác. Ví dụ, Lactate dehydrogenase (LDH) loại bỏ hydrogen khỏi Lactate: Lactate + NAD+ Pyruvate + NADH + H+ Lactate dehydrogenase cũng có thể được đặt tên đầy đủ và chi tiết hơn là L-Lactate: NAD oxydoreductase. Tên này mô tả các cơ chất và loại phản ứng chính xác hơn. Bảng 16.2. Phân loại enzyme (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005) Loại enzyme Phản ứng do enzyme xúc tác Ví dụ phản ứng Oxydoreductase Các phản ứng oxy Lactate dehydrogenase: hóa khử Lactate + NAD+ Pyruvate + NADH + H Transferase Các phản ứng Aspartate Carbamoyltransferase: chuyển nhóm giữa các phân tử Aspartate + CarbamoylPhosphate Carbamoylaspartate + Phosphate Hydrolase Thủy phân các phân tử. Glucose-6-Phosphatease: Glucose-6-Phosphate + H2O Glucose + Pi Lyase Loại bỏ các nhóm Fumarate hydratase: để tạo thành các nối đôi hoặc bổ L-malate Fumarate + H2O sung các nhóm vào nối đôi. Isomerase Các phản ứng xúc Alanine racemase: tác đồng phân hóa. L-alanine D-alanine 35 Ligase Nối 2 phân tử nhờ Glutamine synthetase: năng luợng của ATP (hay của các Glutamate + NH3 + ATP nucleoside Pi triphosphate khác) Glutamine + ATP + 16.2.2. Cơ chế của các phản ứng enzyme Cần nhớ rằng các enzyme tăng cường tốc độ phản ứng nhưng không làm thay đổi hằng số cân bằng. Nếu một phản ứng là thu nhiệt enzyme sẽ không chuyển dịch cân bằng và nhiều sản phẩm hơn sẽ được tạo thành. Các enzyme chỉ nâng cao tốc độ mà ở đó phản ứng diễn ra theo hướng cân bằng cuối cùng. Để hiểu được enzyme xúc tác các phản ứng như thế nào ta hãy xem xét diễn biến của một phản ứng hoá học thải nhiệt bình thường sau đây: A+B C+D Khi các phân tử A và B tiếp cận nhau để phản ứng chúng sẽ tạo thành một phức hợp ở trạng thái quá độ chi cả cơ chất và sản phẩm (Hình 16.13) Hình 16.13: Coenzyme như các chất mang Chức năng của 1 coenzyme trong vai trò mang các chất đi khắp tế bào. Coenzyme C cùng với enzyme E1 tham gia ch uyển hóa A thành sản phẩm B. Trong quá trình phản ứng coenzyme C nhận X từ cơ chất A và có thể chuyển X sang cơ chất P trong phản ứng 2. Kết quả là coenzyme lại trở về dạng ban đẩu để sẵn sàng tiếp nhận 1X khác. Coenzyme không chỉ tham gia vào 2 phản ứng mà còn vận chuyển X đi khắp tế bào. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005) 36 Năng lượng hoạt hoá là cần nhằm mang các phân tử phản ứng tiếp xúc với nhau theo một cách chính xác để đạt được trạng thái quá độ (hay chuyển tiếp). Phức hợp ở trạng thái quá độ có thể phân ly để tạo thành các sản phẩm C và D. Sự khác nhau trong mức độ năng lượng tự do giữa các chất phản ứng và các sản phẩm là ∆Go’. Vì vậy, trong ví dụ nêu trên cân bằng sẽ nằm về phía các sản phẩm vì ∆Go’ là âm (nghĩa là các sản phẩm ở mức năng lượng thấp hơn cơ chất). Trong hình 16.13 rõ ràng A và B không thể chuyển hoá thành C và D nếu chúng không được cung cấp một lượng năng lượng tương đương với năng lượng hoạt hoá. Enzyme thúc đẩy các phản ứng bằng cách hạ thấp năng lượng hoạt hoá. Do đó nhiều phân tử cơ chất hơn sẽ có năng lượng đầy đủ để tiếp cận nhau và tạo thành sản phẩm. Mặc dù hằng số cân bằng (hoặc ∆Go’) không thay đổi nhưng cân bằng sẽ đạt được nhanh hơn khi có mặt enzyme do năng lượng hoạt hoá giảm. Hình 16.14: Enzyme hạ thấp năng luợng hoạt hóa Trong tiến trình của 1 phản ứng hóa học nêu trên A và B được chuyển thành C và D. Phức hợp chuyển tiếp được biểu thị bởi AB* và năng luợng hoạt hóa cần để đạt được trạng thái này bởi Ea. Đường đỏ biểu thị tiến trình của phản ứng trong sự có mặt của 1 enzyme. Cần chú ý, năng luợng hoạt hóa trong phản ứng có enzyme xúc tác thấp hơn rất nhiều. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005) Sở dĩ enzyme có khả năng hạ thấp năng lượng hoạt hoá của các phản ứng vì chúng mang các cơ chất lại gần nhau tại một điểm đặc biệt gọi là vị trí hoạt động hoặc vị trí xúc tác để tạo thành phức hợp enzyme - cơ chất (Hình 16.15 và 16.16). Sự tương tác giữa cơ chất và enzyme có thể diễn ra theo hai con đường: 1. Enzyme có hình dạng cố định, khớp với hình dạng của cơ chất giúp cho cơ chất liên kết chính xác và thuận lợi cho phản ứng diễn ra. 2. Enzyme thay đổi hình dạng khi gắn với cơ chất tạo điều kiện cho vị trí xúc tác bao quanh và khớp chính xác với cơ chất. Cơ chế diễn ra theo con đường thứ nhất được gọi là mô hình “ổ khoá và chìa khoá” (lock - and - key model). Theo con đường thứ hai cơ chế được gọi là mô hình “khớp cảm ứng” (induced fit). Mô hình này được ứng dụng cho hexokinase và nhiều enzyme khác (Hình 16.16). 37 Hình 16.15. Chức năng của enzyme. Sự tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất và chuyển hóa phức hợp thành 1 sản phẩm. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005) Việc tạo thành phức hợp enzyme - cơ chất có thể hạ thấp năng lượng hoạt hoá theo một số cách. Chẳng hạn, bằng cách mang các cơ chất lại gần nhau tại vị trí xúc tác, trên thực tế, enzyme đã làm tăng nồng độ của chúng và thúc đẩy phản ứng. Tuy nhiên, một enzyme không chỉ đơn giản làm đậm đặc nồng độ các cơ chất của chúng mà còn liên kết các cơ chất sao cho các cơ chất này hướng chính xác với nhau để tạo thành phức hợp ở trạng thái quá độ. Một sự định hướng như vậy sẽ hạ thấp lượng năng lượng mà các cơ chất cần để đạt được trạng thái quá độ. Các hoạt tính này và các hoạt tính khác của vị trí xúc tác đã tăng cường phản ứng hàng trăm nghìn lần bất kể vi sinh vật sinh trưởng giữa 200C và khoảng 1130C. Những nhiệt độ này không đủ cao để giúp cho hầu hết các phản ứng hữu cơ trong sự vắng mặt của enzyme, hơn nữa các tế bào không thể sống sót ở những nhiệt độ cao dùng bởi một nhà hoá học hữu cơ trong các quá trình tổng hợp hữu cơ thường ngày. Enzyme giúp cho sự sống tồn tại bằng cách thúc đẩy các phản ứng đặc biệt ở nhiệt độ thấp. 38 Hình 16.16. Một ví dụ về sự tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất a) Mô hình đầy đủ của hexokinase nấm men và cơ chất Glucose (màu tía). Vị trí hoạt động trong khe tạo thành bởi thùy nhỏ của enzyme (màu lục) và thùy lớn (màu xám). (b) Khi Glucose liên kết để tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất hexokinase thay đổi hình dạng và bao quanh cỏ chất. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005) 16.2.3. Tác động của môi trường lên hoạt tính enzyme Hoạt tính enzyme thay đổi rõ rệt với sự thay đổi của các yếu tố môi trường mà một trong các yếu tố quan trọng nhất là nồng độ cơ chất. Như ta đã biết, nồng độ các cơ chất bên trong tế bào thường thấp. Ở nồng độ cơ chất rất thấp enzyme chậm tạo thành sản phẩm do ít khi được tiếp xúc với phân tử cơ chất. Nếu có mặt nhiều phân tử cơ chất hơn enzyme sẽ liên kết cơ chất thường xuyên hơn và tốc độ phản ứng (thường được thể hiện như tốc độ tạo thành sản phẩm) cũng lớn hơn ở nồng độ cơ chất thấp hơn. Do đó tốc độ của một phản ứng do enzyme xúc tác tăng lên theo nồng độ cơ chất (Hình 16.17). Tuy nhiên nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng cũng không tăng nữa vì các phân tử enzyme đã bão hoà cơ chất và đang chuyển hoá cơ chất thành sản phẩm với tốc độ cực đại (Vmax). Đường cong của nồng độ cơ chất bây giờ sẽ là đường hyperbole (Hình 16.17). Để biết được nồng độ cơ chất mà một enzyme cần để hoạt động thích hợp người ta thường dùng hằng số Michaelis (Km). Đây là nồng độ cơ chất enzyme cần để thực hiện được một nửa tốc độ cực đại và được dùng như một đại lượng đo ái lực thực sự của một enzyme đối với cơ chất. Giá trị Km càng thấp có ý nghĩa là nồng độ cơ chất mà enzyme xúc tác phản ứng cũng càng thấp.Hoạt tính enzyme cũng thay đổi theo sự thay đổi của pH và nhiệt độ (hình 16.18). Hình 16.17. Động học Michaelis-Menten Velocity= tốc độ, Substrate concentration: nồng độ cơ chất 39 Sự phụ thuộc của hoạt tính enzyme vào nồng độ cơ chất. Đường cong cơ chất ở đây khớp với phương trình Michaelis-Menten cho trong hình; phương trình này liên kết tốc độ phản ứng (v) với nồng độ cơ chất (S) khi sử dụng tốc độ cực đại và hằng số Michaelis (Km). Km = nồng độ cơ chất enzyme cần để hoạt động ở nửa tốc độ cực đại. Vmax = tốc độ tạo thành sản phẩm khi enzyme được bão hòa cơ chất và hoạt động nhanh tối đa. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005) Mỗi enzyme hoạt động mạnh nhất ở một pH thích hợp nhất. Khi pH chệch xa khỏi giá trị tối thích hoạt tính của enzyme sẽ giảm đi và enzyme có thể bị hư hại. Với nhiệt độ enzyme cũng có giá trị tối thích cho hoạt tính cực đại. Nếu nhiệt độ tăng quá cao so với giá trị tối thích cấu trúc của enzyme sẽ bị huỷ hoại và enzyme mất hoạt tính. Hiện tượng biến tính (denaturation) này của enzyme có thể là hậu quả của các giá trị quá độ (tột cùng) của pH và nhiệt độ hoặc các yếu tố khác. Các giá trị tối thích của pH và nhiệt độ của các enzyme vi sinh vật thường phản ánh pH và nhiệt độ nơi sống của chúng. Do đó, ta dễ hiểu, các vi khuẩn sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ cao thường có các enzyme với nhiệt độ tối thích cao và độ bền nhiệt độ lớn. Hình 16.18: pH, nhiệt độ và hoạt tính enzyme Sự thay đổi hoạt tính enzyme cùng với những thay đổi trong pH và nhiệt độ. Phạm vi pH và nhiệt độ ở đây chỉ là tượng trưng. Các enzyme khác nhau về vị trí của điểm tối thích và hình dạng của các đường cong pH và nhiệt độ. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005) 16.2.4. Sự kìm hãm enzyme Nhiều hoá chất là độc đối vi sinh vật và những chất độc mạnh nhất chính là những chất kìm hãm enzyme. Một chất kìm hãm cạnh tranh trực tiếp cạnh tranh với cơ chất ở vị trí xúc tác của một enzyme và ngăn cản enzyme tạo thành sản phẩm. Chẳng hạn, succinate dehydrogenase là enzyme xúc tác sự oxy hoá succinate thành fumarate trong chu trình Krebs. Acid malonic có cấu trúc tương tự succinate do đó là chất kìm hãm cạnh tranh của enzyme nói trên. Sau khi liên kết vào enzyme malonat không bị oxy hoá và việc tạo thành fumarate không diễn ra. Các chất kìm hãm cạnh tranh thường chi với các cơ chất bình thường nhưng không thể bị chuyển hoá thành các sản phẩm. 40 Hình 16.19: Kìm hãm cạnh tranh của succinate-dehydrogenase Acid malonic có cấu trúc tương tự acid succinic do đó là chất kìm hãm cạnh tranh của enzyme nói trên. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005) Các chất kìm hãm cạnh tranh được sử dụng để điều trị nhiều bệnh do vi sinh vật. Chẳng hạn các thuốc sulfa như sulfanilamit chi với p-aminobenzoat là một phân tử dùng trong việc tạo thành coenzyme acid folic. Các thuốc cạnh tranh với p-aminobenzoat đối với vị trí xúc tác của một enzyme tham gia tổng hợp acid folic do đó ngăn cản sự tạo thành acid folic và kìm hãm sinh trưởng của vi khuẩn. Cơ thể người không chịu tác dụng của thuốc do không có khả năng tổng hợp acid folic và phải thu nhận acid này từ thức ăn. 16.3. TÍNH CHẤT VÀ Ý NGHĨA CỦA VIỆC ĐIỀU CHỈNH TRAO ĐỔI CHẤT Bộ máy điều chỉnh có vai trò cực kỳ phức tạp và khó khăn. Các con đường cần phải điều chỉnh và phối hợp có hiệu quả sao cho tất cả các thành phần của tế bào đều có mặt với số lượng thích hợp, chính xác. Hơn nữa tế bào vi sinh vật phải có khả năng đáp ứng rất kịp thời với những thay đổi của môi trường bằng cách sử dụng các chất dinh dưỡng hiện có và bằng cách bật mở các con đường dị hoá mới khi có mặt các chất dinh dưỡng khác. Vì tất cả các thành phần hoá học của một tế bào thường không tồn tại trong môi trường, do đó vi sinh vật cũng phải tổng hợp chúng và phải thay đổi hoạt tính sinh tổng hợp đáp ứng với những thay đổi trong việc sử dụng chất dinh dưỡng. Thành phần hoá học của môi trường bao quanh tế bào thường xuyên thay đổi, do đó các quá trình điều chỉnh này cũng phải năng động và phải liên tục đáp ứng với các điều kiện thay đổi. Việc điều chỉnh là cần thiết cho tế bào vi sinh vật duy trì được năng lượng, vật chất và cân bằng trao đổi chất. Nếu một nguồn năng lượng đặc biệt không có mặt, các enzyme cần cho việc sử dụng nguồn năng lượng này là không cần thiết và việc tổng hợp chúng tiếp tục sẽ là một sự tiêu phí C, N và năng lượng. Cũng tương tự như vậy, sẽ là rất vô ích đối với vi sinh vật nếu chúng tổng hợp các enzyme cần cho việc tạo thành một sản phẩm cuối cùng nào đó khi sản phẩm này đã có mặt với số lượng đầy đủ. Như vậy, cả dị hoá và đồng hoá đều được điều chỉnh theo cách sao cho hiệu quả của hoạt động đạt được tối đa. Có thể thấy rõ xu hướng duy trì cân bằng và bảo tồn năng lượng của vật chất trong sự đáp ứng điều chỉnh ở vi khuẩn E. coli... Khi sinh trưởng trong một môi trường rất đơn giản chỉ chứa glucose là nguồn C và nguồn năng lượng vi khuẩn sẽ tổng hợp các thành phần mà tế bào cần với số lượng cân bằng (chẳng hạn acid amin tryptophan). Việc bổ sung một sản phẩm sinh tổng hợp cuối cùng vào môi trường sẽ dẫn đến kìm hãm ngay lập tức con đường tổng hợp sản phẩm cuối cùng nói trên. Việc tổng hợp các enzyme của con 41 đường cũng sẽ bị ngừng hoặc chậm lại. Nếu chuyển E. coli sang môi trường chỉ chứa lactose, vi khuẩn sẽ tổng hợp các enzyme cần cho sự chuyển hoá đường này. Trái lại, khi sinh trưởng trong môi trường chứa cả glucose và lactose E. coli sẽ sử dụng glucose đầu tiên vì đây là loại đường đơn giúp cho sinh trưởng của vi khuẩn diễn ra nhanh nhất chỉ sau khi glucose đã cạn kiệt, lactose mới được sử dụng. Dòng carbon chuyển hoá qua con đường có thể được điều chỉnh theo ba cách chủ yếu: 1. Tập trung các chất trao đổi và các enzyme trong những phần khác nhau của tế bào, từ đó ảnh hưởng đến hoạt tính của con đường, 2. Các enzyme quan trọng thường được kích thích hoặc bị kìm hãm trực tiếp nhằm thay đổi nhanh hoạt tính của con đường, 3. Số lượng các phân tử enzyme cũng có thể được điều hoà. Các phân tử chất xúc tác có mặt càng nhiều thì hoạt tính của con đường càng lớn. Ở vi khuẩn, việc điều chỉnh thường chịu tác dụng ở mức độ phiên âm. Việc điều hoà tổng hợp mRNA chậm hơn việc điều chỉnh trực tiếp hoạt tính enzyme nhưng tiết kiệm được nhiều năng lượng và nguyên liệu vì các enzyme không được tổng hợp khi không cần thiết. Hai cơ chế 1 và 2 sẽ được trình bày ở đây, đó là: khu trú trao đổi chất và điều hoà hoạt tính enzyme. 16.4. KHU TRÚ TRAO ĐỔI CHẤT (Metabolic Channeling) Một trong các cơ chế khu trú trao đổi chất phổ biến nhất là sự chia khoang (compartmentation) nghĩa là sự phân bố biệt hoá các enzyme và các chất trao đổi trong các cấu trúc tế bào tách biệt hoặc các bào quan có màng bao bọc. Chẳng hạn, sự oxy hoá acid béo gặp bên trong ti thể nhưng tổng hợp acid béo lại diễn ra trong tế bào chất. Chu chất ở vi khuẩn cũng có thể được xem là một ví dụ của sự chia khoang. Sự chia khoang tạo điều kiện cho việc hoạt động và điều chỉnh đồng thời nhưng tách biệt của các con đường có thể được phối hợp nhờ sự điều chỉnh việc vận chuyển các chất trao đổi và các coenzyme giữa các khoang của tế bào. Giả dụ, có hai con đường tồn tại trong các khoang tế bào khác nhau nhưng đều cần NAD+ cho hoạt động. Sự phân bố NAD+ giữa hai khoang sẽ quyết định hoạt tính tương đối của các con đường cạnh tranh này và con đường nào chiếm dư thừa NAD+ sẽ có lợi thế hơn. Sự chia khoang cũng gặp bên trong các khoang như nền tế bào chất. Nền (matrix) là vật thể đông đặc, có cấu trúc gồm nhiều khoang nhỏ. Ở sinh vật nhân thật nền cũng được chia nhỏ bởi lưới nội chất (endoplasmic reticulum) và bộ khung tế bào (cytoskeleton). Trong một môi trường như vậy các chất trao đổi và các coenzyme không khuếch tán nhanh và các gradien chất trao đổi sẽ được thiết lập gần các enzyme hoặc các hệ thống enzyme cục bộ. Điều này diễn ra vì các enzyme ở một vị trí đặc biệt chuyển hoá các chất thành sản phẩm dẫn đến giảm nồng độ của một hoặc nhiều chất trao đổi này và tăng nồng độ của một hoặc nhiều chất trao đổi khác. Chẳng hạn, nồng độ sản phẩm sẽ cao ở gần enzyme và thấp dần theo khoảng cách tăng lên tính từ enzyme. 42 Sự khu trú có thể tạo ra những thay đổi rõ rệt trong nồng độ chất trao đổi và vì vậy ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt tính enzyme. Nồng độ cơ chất, nói chung, thường ở vào khoảng 10-3 - 10-6M/l, thậm chí thấp hơn, nghĩa là có thể ở trong cùng phạm vi như nồng độ enzyme và bằng hoặc nhỏ hơn hằng số Michaelis (Km) của nhiều enzyme. Dưới các điều kiện như vậy nồng độ cơ chất của một enzyme có thể điều hoà hoạt tính của chất xúc tác vì nồng độ cơ chất là ở trong phần tăng lên của đường cong hyperbole của sự bão hoà cơ chất (Hình 16.20). Hình 16.20: Điều hòa hoạt tính enzyme bởi nồng độ cơ chất Trong hình là đường cong bão hòa enzyme-cơ chất với hằng số Michaelis (Km) và tốc độ tương đương với ½ tốc độ cực đại (Vmax). Tốc độ ban đầu của phản ứng (v) được dựng đồ thị đối với nồng độ cơ chất. Tốc độ cực đại là tốc độ lớn nhất đạt được với một số lượng enzyme cố định dưới những điều kiện xác định. Khi nồng độ cơ chất bằng hoặc nhỏ hơn Km hoạt tính enzyme sẽ thay đổi hầu như tuyến tính với nồng độ cơ chất. Giả dụ, nồng độ cơ chất tăng từ mức độ A tới mức độ B. Vì những nồng độ này đều ở trong phạm vi của Km nên hoạt tính enzyme tăng lên rõ rệt. Sự giảm nồng độ từ B đến A sẽ hạ thấp tốc độ tạo thành sản phẩm. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005) Khi nồng độ cơ chất tăng, cơ chất sẽ được chuyển thành sản phẩm nhanh hơn; nồng độ cơ chất giảm đương nhiên dẫn đến hoạt tính enzyme thấp hơn. Nếu 2 enzyme ở hai con đường khác nhau cùng sử dụng một chất trao đổi chúng có thể trực tiếp cạnh tranh chất này, con đường thắng trong cuộc cạnh tranh này, nghĩa là con đường với enzyme có giá trị Km thấp nhất đối với chất trao đổi, sẽ hoạt động gần như hoàn toàn thống trị. Do đó sự khu trú bên trong một khoang tế bào có thể điều chỉnh và phối hợp trao đổi chất thông qua những biến đổi trong nồng độ chất trao đổi và nồng độ coenzyme. 16.5. ĐIỀU HÒA HOẠT TÍNH ENZYME Hoạt động của nhiều con đường trao đổi chất có thể được điều hoà nhờ việc điều chỉnh hoạt tính của các enzyme điều chỉnh. Mục này mô tả các enzyme nói trên và đề cập vai trò của chúng trong việc điều chỉnh hoạt tính của con đường. 43 16.5.1. Điều chỉnh dị lập thể Các enzyme điều chỉnh thường là các enzyme dị lập thể (allosteric enzymes). Hoạt tính của một enzyme dị lập thể bị thay đổi bởi một phân tử nhỏ gọi là effector (effector, chất tác động) hoặc modulator (modulator, chất điều biến). Effector liên kết thuận nghịch nhờ lực không - cộng hoá trị vào một vị trí điều chỉnh (regulatory site) tách biệt khỏi vị trí xúc tác (catalytic site) và gây ra sự thay đổi trong hình dạng hoặc hình thể của enzyme (Hình 16.21). Hoạt tính của vị trí xúc tác do đó bị thay đổi. Một effector dương làm tăng hoạt tính enzyme, một effector âm, trái lại, làm giảm hoạt tính hoặc kìm hãm enzyme. Những thay đổi như vậy trong hoạt tính thường bắt nguồn từ những biến đổi trong ái lực biểu kiến của enzyme đối với cơ chất, tuy nhiên những thay đổi trong tốc độ cực đại cũng có thể diễn ra. Hình 16.21: Điều chỉnh dị lập thể Cấu trúc và chức năng của 1 enzyme dị lập thể. Trong hình bên effector hoặc modulator (chất điều biến) trước hết gắn vào 1 vị trí điều hòa tách biệt và làm thay đổi hình thể enzyme dẫn đến sự thay đổi hình dạng của vị trí hoạt động. Vị trí hoạt động giờ có thể liên kết cơ chất hiệu quả hơn. Ở đây effector là dương tính vì nó kích thích sự liên kết cơ chất và hoạt tính xúc tác. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005) Các enzyme điều chỉnh thường là các enzyme dị lập thể (allosteric enzymes). Hoạt tính của một enzyme dị lập thể bị thay đổi bởi một phân tử nhỏ gọi là effector (effector, chất tác động) hoặc modulator (modulator, chất điều biến). Effector liên kết thuận nghịch 44 nhờ lực không - cộng hoá trị vào một vị trí điều chỉnh (regulatory site) tách biệt khỏi vị trí xúc tác (catalytic site) và gây ra sự thay đổi trong hình dạng hoặc hình thể của enzyme (Hình 16.21). Hoạt tính của vị trí xúc tác do đó bị thay đổi. Một effector dương làm tăng hoạt tính enzyme, một effector âm, trái lại, làm giảm hoạt tính hoặc kìm hãm enzyme. Những thay đổi như vậy trong hoạt tính thường bắt nguồn từ những biến đổi trong ái lực biểu kiến của enzyme đối với cơ chất, tuy nhiên những thay đổi trong tốc độ cực đại cũng có thể diễn ra. Hình 16.22: Sự điều chỉnh ACTase Phản ứng Aspartate- carbamoyltransferase và vai trò của enzyme này trong việc điều chỉnh sinh tổng hợp pyrimidine. Sản phẩm cuối cùng CTP kìm hãm hoạt tính của ACTase (-) còn ATP lại hoạt hóa enzyme (+). Cacbamoyl Phosphate synthetase cũng bị kìm hãm bởi các sản phẩm cuối cùng của con đường như UMP. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005) Các đặc tính động học của enzyme không - điều chỉnh chứng minh rằng hằng số Michaelis (Km) là nồng độ cơ chất cần cho một enzyme hoạt động ở tốc độ bằng nửa tốc độ cực đại. Hằng số này chỉ ứng dụng cho các đường cong bão hoà cơ chất hyperbole mà không cho các đường cong xích-ma thường gặp với các enzyme dị lập thể (Hình 16.23). Nồng độ cơ chất cần cho một nửa tốc độ cực đại với các enzyme dị lập thể có đường cong cơ chất xích-ma được gọi là giá trị [S]0,5 hoặc K0,5. Một trong các enzyme điều chỉnh dị lập thể được nghiên cứu kỹ nhất đó là Aspartatecarbamoyltransferase (ACTase) ở E. coli. Enzyme xúc tác sự ngưng tụ của cacbamoylphosphate với aspartate tạo thành cacbamoylaspartate (Hình 16.22). 45 ACTase xúc tác phản ứng quyết định tốc độ của con đường sinh tổng hợp pyrimidine ở E. coli. Đường cong cơ chất bão hoà là xích-ma khi nồng độ của một trong hai cơ chất thay đổi (Hình 16.23) Hình 16.23: Động học của Aspartate carbamoyltransferase ở E. coli CTP là 1 effector âm làm tăng giá trị K0,5, còn ATP là 1 effector dương, hạ thấp K0,5. Vmax vẫn là hằng số. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005) Enzyme có trên một vị trí hoạt động và sự liên kết của một phân tử cơ chất vào một vị trí hoạt động sẽ kích thích sự liên kết của cơ chất vào các vị trí khác. Hơn nữa, cytidine triphosphate (CTP), một sản phẩm cuối cùng của sinh tổng hợp pyrimidine, kìm hãm enzyme, trái lại ATP (purine) lại hoạt hoá enzyme. Cả hai effector thay đổi giá trị K0,5 của enzyme nhưng không thay đổi tốc độ cực đại của enzyme. GTP kìm hãm bằng cách nâng cao K0,5 hoặc chuyển dịch đường cong bão hoà cơ chất lên các giá trị cao hơn. Điều này cho phép enzyme hoạt động chậm hơn ở một nồng độ cơ chất đặc biệt khi CTP có mặt. ATP hoạt hoá bằng cách chuyển đường cong tới các giá trị nồng độ cơ chất thấp hơn khiến cho enzyme hoạt động cực đại qua một phạm vi nồng độ cơ chất rộng lớn. Do đó, khi con đường hoạt động tới mức nồng độ CTP tăng quá cao hoạt tính ACTase sẽ giảm và tốc độ tạo thành sản phẩm cuối cùng bị chậm lại. Trái lại, khi nồng độ sản phẩm cuối cùng ATP tăng lên so với CTP, ATP sẽ kích thích tổng hợp CTP thông qua tác dụng lên ACTase. Aspartate carbamoyltransferase ở E. coli cung cấp một ví dụ rõ rệt về các vị trí điều chỉnh và vị trí xúc tác riêng rẽ trong các enzyme dị lập thể. Enzyme là một protein lớn gồm 2 dưới đơn vị xúc tác và 3 dưới đơn vị điều chỉnh (Hình 16.24a). Các dưới đơn vị xúc tác chỉ chứa các vị trí xúc tác và không chịu ảnh hưởng bởi CTP và ATP. Các dưới đơn vị điều chỉnh không xúc tác phản ứng nhưng có các vị trí điều chỉnh liên kết CTP và ATP. Khi liên kết vào enzyme hoàn toàn các effector này gây ra những thay đổi về hình thể trong các dưới-đơn vị điều chỉnh, sau đó trong các dưới đơn vị xúc tác và các vị trí xúc tác. Enzyme có thể thay đổi thuận nghịch giữa một dạng T ít hoạt động và một dạng 46 R hoạt động hơn (Hình 16.24 b, c). Do đó vị trí điều chỉnh ảnh hưởng đến vị trí xúc tác ở khoảng cách khoảng 6,0 nm. Hình 16.24: Cấu trúc và điều chỉnh của Aspartate carbamoyltransferase ở E. coli. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005) 16.5.2. Cải biến cộng hoá trị các enzyme Các enzyme cũng có thể được kích thích hoặc bị kìm hãm thông qua sự cải biến cộng hoá trị thuận nghịch. Thông thường điều này diễn ra do việc thêm và loại bỏ một nhóm đặc biệt, nghĩa là một dạng của enzyme được hoạt động hơn một dạng khác. Chẳng hạn, glycogen phosphorylase của mốc bánh mì Neurospora crassa được gọi là phosphorylase a khi ở dạng phosphoryl hoá và phosphorylase b khi ở dạng bị loại bỏ Phosphate (Hình 16.25). Phosphorylase b là bất hoạt vì chất hoạt hoá AMP mà nó cần thường không có mặt ở mức độ đủ cao. Dạng phosphoryl hoá của phosphorylase a hoạt động ngay khi không có mặt AMP. Glycogen phosphorylase được kích thích thông qua việc phosphoryl hóa phosphorylase b thành phosphorylase a. Việc gắn nhánh Phosphate làm thay đổi hình thể của enzyme chuyển nó thành dạng hoạt động. Phản ứng phosphoryl hoá và loại bỏ Phosphate được xúc tác bởi các enzyme riêng rẽ và các enzyme này cũng được điều chỉnh. 47 Hình 16.25: Sự cải biến cộng hóa trị thuận nghịch của glycogen phosphorylase. Phosphorylase a là dạng hoạt động được tổng hợp bởi phosphoryl hóa và bị bất hoạt khi Phosphate bị loại bỏ do thủy phân để tạo thành phosphorylase b bất hoạt. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005) Các enzyme cũng có thể được điều chỉnh nhờ liên kết với các nhóm khác Phosphate. Một trong các enzyme được nghiên cứu chi tiết nhất đó là Glutamine synthetase ở E. coli. Đây là một enzyme lớn, phức tạp tồn tại ở hai dạng. Khi một nhánh acid adenylic liên kết với một trong 12 dưới-đơn vị của enzyme tạo thành một enzyme adenyl hoá, glutamine synthetase hoạt động yếu. Việc loại bỏ các nhóm AMP tạo ra glutamine synthetase đã mất adenyl hoạt động hơn và glutamine được tổng hợp. Hệ thống glutamine synthetase khác hệ thống phosphorylase ở hai điểm: 1) AMP được dùng như tác nhân cải biến; 2) Dạng cải biến của Glutamine synthetase kém hoạt động. Glutamine synthetase cũng được điều chỉnh dị lập thể. Việc sử dụng cải biến cộng hoá trị để điều chỉnh hoạt tính enzyme có một số ưu điểm. Các enzyme có thể chuyển hoá qua lại thường cũng là các enzyme dị lập thể. Vì mỗi dạng có thể đáp ứng khác nhau với các effector dị lập thể nên các hệ thống enzyme cải biến cộng hoá trị có khả năng đáp ứng với nhiều chất kích thích hơn trong các con đường thay đổi và phức tạp. Cũng có thể được điều chỉnh là các enzyme xúc tác những cải biến cộng hoá trị, bổ sung vào hệ thống một mức độ điều chỉnh thứ hai. 16.5.3. Kìm hãm phản hồi hoặc kìm hãm bởi sản phẩm cuối cùng (Feedback inhibition) Như đã nói ở phần trên, tốc độ của nhiều con đường trao đổi chất được điều chỉnh thông qua sự điều khiển hoạt tính của các enzyme điều chỉnh. Mỗi con đường có ít nhất một enzyme dẫn-tốc độ (pacemaker) xúc tác phản ứng chậm nhất hoặc hạn chế tốc độ trong con đường. Vì các phản ứng khác diễn ra nhanh hơn phản ứng dẫn-tốc độ do đó những thay đổi trong hoạt tính của enzyme này trực tiếp ảnh hưởng đến tốc độ của con đường. Thông thường, bước thứ nhất trong một con đường là một phản ứng dẫn tốc độ xúc tác bởi một enzyme điều chỉnh. Sản phẩm cuối cùng của con đường thường kìm hãm enzyme điều chỉnh này. Quá trình nói trên được gọi là sự kìm hãm bởi sản phẩm cuối cùng. Kiểu kìm hãm này bảo đảm cho sự tạo thành cân bằng của sản phẩm cuối cùng của một con đường. Nếu tích luỹ với nồng độ quá cao sản phẩm cuối cùng sẽ kìm hãm enzyme điều chỉnh và làm giảm tốc độ tổng hợp của chính sản phẩm này. Khi nồng độ của sản phẩm cuối cùng giảm, hoạt tính của con đường lại tăng và nhiều sản phẩm hơn được tạo thành. Sự kìm hãm bởi sản phẩm cuối cùng, nhờ vậy, đã tự động phối hợp việc cung cấp theo nhu cầu của sản phẩm này. Aspartate carbamoyltransferase là một ví dụ điển hình của sự kìm hãm bởi sản phẩm một con đường sinh tổng hợp thường phân nhánh tạo thành trên một sản phẩm cuối cùng. Trong tình hình như vậy việc tổng hợp các sản phẩm cuối cùng của con đường phải được phối hợp một cách chính xác. Không thể để một sản phẩm cuối cùng này có mặt dư thừa trong khi một sản phẩm cuối cùng khác lại thiếu. Sự phân nhánh các con đường sinh tổng hợp thường tạo nên sự cân bằng giữa các sản phẩm cuối cùng qua việc sử dụng các enzyme điều chỉnh ở các điểm phân nhánh (Hình 16.26). 48 Khi có mặt ở nồng độ dư thừa một sản phẩm cuối cùng thường kìm hãm enzyme ở điểm phân nhánh trên chuỗi dẫn đến tạo thành sản phẩm này, nhờ vậy mà điều chỉnh việc tổng hợp của chính sản phẩm đó nhưng không ảnh hưởng đến tổng hợp các sản phẩm khác. Hình 16.26 cũng cho thấy cả 2 sản phẩm cũng kìm hãm enzyme mở đầu trong con đường. Sự dư thừa của một sản phẩm làm chậm dòng C đi vào cả con đường trong khi kìm hãm enzyme thích hợp ở điểm phân nhánh. Vì sự phân nhánh không hoạt động cần ít C do đó sự kìm hãm bởi sản phẩm cuối cùng của enzyme dẫn tốc độ ban đầu giúp cho sự điều hoà giữa cung và cầu ở các con đường phân nhánh. Việc điều chỉnh ở các con đường phân nhánh nhiều thường được thực hiện phức tạp hơn do sự có mặt của các izoenzyme tức là những enzyme khác nhau nhưng xúc tác cùng một phản ứng. Bước đầu dẫn tốc độ ban đầu có thể do một số izoenzyme xúc tác, mỗi izoenzyme chịu sự điều hoà riêng rẽ và độc lập. Trong tình hình như vậy, sự dư thừa của một sản phẩm cuối cùng sẽ làm giảm hoạt tính của con đường nhưng không hoàn toàn kìm hãm chức năng của con đường vì một số izoenzyme vẫn còn hoạt động. Hình 16.26: Kìm hãm phản hồi Trên hình là sự kìm hãm phản hồi trong 1 con đường phân nhánh với 2 sản phẩm cuối cùng. Các enzyme ở điểm phân nhánh xúc tác sự chuyển hóa chất trung gian E thành F và G được điều chỉnh bởi kìm hãm phản hồi. Các sản phẩm P và Q cũng kìm hãm phản ứng mở đầu trong con đường. Tín hiệu ① chỉ ra rằng P hoặc Q kìm hãm enzyme xúc tác bước tiếp theo tín hiệu. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005) 49