Nội dung

Bài 4 Các nhóm vi khuẩn chủ yếu Theo quan điểm hiện đại (NCBI- National Center for Biotechnology Information, 2005) thì vi khuẩn bao gồm các ngành sau đây : 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. -Aquificae -Thermotogae -Thermodesulfobacteria -Deinococcus-Thermus -Chrysiogenetes -Chloroflexi -Nitrospirae -Defferribacteres -Cyanobacteria -Proteobacteria -Firmicutes -Actinobacteria -Planctomycetes -Chlamydiae/Nhóm Verrucomicrobia -Spirochaetes -Fibrobacteres /Nhóm Acidobacteria -Bacteroidetes/Nhóm Chlorobia -Fusobacteria -Dictyoglomi Việc phân ngành dựa trên các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, sinh thái... Căn cứ vào tỷ lệ G + C trong ADN người ta xây dựng được cây phát sinh chủng loại (Phylogenetic tree) và chia vi khuẩn thành 11 nhóm sau đây : 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. -Nhóm Oxy hoá Hydrogen -Nhóm Chịu nhiệt -Nhóm Vi khuẩn không lưu huỳnh màu lục -Nhóm Deinococcus -Nhóm Vi khuẩn lam -Nhóm Proteobacteria -Nhóm Chlamydia -Nhóm Planctomyces -Nhóm Spirochaetes (Xoắn thể) -Nhóm Vi khuẩn lưu huỳnh màu lục -Nhóm Cytophaga --Nhóm Vi khuẩn Gram dương Sơ đồ về các loài điển hình Để có khái niệm về các chi vi khuẩn thường gặp chúng ta làm quen với một số khoá phân loại đơn giản, dựa trên các đặc điểm về hình thái, sinh lý , sinh hoá. Trong thực tiễn với các loài vi khuẩn gây bệnh người ta thường chẩn đoán thêm bằng phản ứng huyết thanh (với các kháng thể đặc hiệu) 1.Vi khuẩn quang hợp (Phototrophic bacteria) : 1.1.Vi khuẩn lưu huỳnh màu tía (Purple sulfur bacteria): Thuộc nhóm này là các vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, có khả năng quang tự dưỡng vô cơ (photolithoautotroph), tế bào có chứa chlorophyll a hoặc b , hệ thống quang hợp chứa các màng hình cầu hay hình phiến (lamellar) gắn với màng sinh chất. Để dùng làm nguồn cho điện tử (electron donors) trong quang hợp thường sử dụng H 2, H2S hay S . Có khả năng di động với tiên mao mọc ở cực, có loài chu mao, tỷ lệ G+C là 45-70%. a- Họ Chromatiaceae: 1.1.1- Chi Thiospirium 1.1.2. Chi Chromatium 1.1.3. Chi Thiocapsa 1.1.4. Chi Thiocystis 1.1.5. Chi Thiospirillum 1.1.6. Chi Thiorhodovibrio 1.1.7. Chi Amoebobacter 1.1.8. Chi Lamprobacter 1.1.9. Chi Lamprocystis 1.1.10.Chi Thiodyction 1.1.11.Chi Thiopedia 1.1.12. Chi Rhabdochromatium 1.1.13. Chi Thiorhodococcus Chromatium Thiocystis Thiocapsa Thiospirillum Lamprocystis Thiopedia b- Họ Ectothiorhodospiraceae: 1.1.14- Chi Ectothiorhodospirace 1.1.15- Chi Halorhodospira 1.2-Vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía (Nonsulfure purple bacteria) Vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía là nhóm vi khuẩn quang dị dưỡng hữu cơ (photoorganoheterotrophs) thường kỵ khí bắt buộc, một số loài là quang tự dưỡng vô cơ không bắt buộc (trong tối là hoá dị dưỡng hữu cơ- chemoorganoheterotrophs). Tế bào chứa chlorophyl a hoặc b, hệ thống quang hợp chứa các màng hình cầu hay hình phiến (lamellar) gắn với màng sinh chất. Để dùng làm nguồn cho điện tử (electron donors) trong quang hợp thường sử dụng chất hữu cơ, đôi khi sử dụng hợp chất lưu huỳnh dạng khử hoặc H 2. Có khả năng di động với tiên mao mọc ở cực, hoặc không di động, một số loài có túi khí (gas vesicles), tỷ lệ G+C là 61-72%. 1.2.1- Chi Blastochloris 1.2.2- Chi Phaeospirillum 1.2.3- Chi Rhodobacter 1.2.4- Chi Rhodobium 1.2.5- Chi Rhodocista 1.2.6- Chi Rhodocyclus 1.2.7- Chi Rhooferax 1.2.8- Chi Rhodomicrobium 1.2.9- Chi Rhodoplanes 1.2.10-Chi Rhodopila 1.2.11- Chi Rhodopseudomonas 1.2.12- Chi Rhodospira 1.2.13- Chi Rhodospirillum 1.2.14- Chi Rhodothalassium 1.2.15- Chi Rhodovibrio 1.2.16-Chi Rhodovulum 1.2.17- Chi Rosespira 1.2.18- Chi Rubiviva Rhodospirillum Rhodospirillum dưới KHV điệntử Rhodopseudomonas Rhodobacter Rhodopseudomonas dưới KHV điện tử Rhodopila Rhodocyclus purpureus Rhomicrobium 1.3.Vi khuẩn lưu huỳnh màu lục (Green sulfure bacteria) Thuộc nhóm này là các vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, có khả năng quang tự dưỡng vô cơ (photolithoautotroph), tế bào có chứa chlorophyll a cùng với b , c hoặc e, chứa caroten nhóm 5, hệ thống quang hợp liên quan đến các lục thể (chlorosom) và độc lập đối với màng sinh chất. Để dùng làm nguồn cho điện tử (electron donors) trong quang hợp thường sử dụng H 2, H2S hay S . Hạt lưu huỳnh tích luỹ bên ngoài tế bào Không có khả năng di động , một số loài có túi khí; tỷ lệ G+C là 48-58%. 1.3.1- Chi Chlorobium 1.3.2- Chi Prosthecochloris 1.3.3- Chi Pelodictyon 1.3.4- Chi Ancalichliris 1.3.5- Chi Chloroherpeton Chlorobium Pelodictyon Prosthecochloris 1.4.Vi khuẩn không lưu huỳnh màu lục (Green nonsulfur bacteria) Thuộc nhóm này là các vi khuẩn đa bào, dạng sợi,thường kỵ khí không bắt buộc ,thường là quang dị dưỡng (photoheterotroph), có loài quang tự dưỡng hoặc hoá dị dưỡng. Tế bào có chứa chlorophyll a và c, trong điều kiện kỵ khí thấy có chlorosom. Để dùng làm nguồn cho điện tử (electron donors) trong quang dị dưỡng là glucose, axit amin, axit hữu cơ; trong quang tự dưỡng là H2, H2S. Di động bằng phương thức trườn (gliding) , tỷ lệ G+C là 53-55%. Chi điển hình là Chloroflexus., Chloronema Chloronema Chloroflexus 1.5- Vi khuẩn lam (Ngành Cyanobacteria) Trước đây thường nhầm lẫn là Tảo lam (Cyanophyta). Thực ra đây là những cơ thể nhân nguyên thuỷ, không liên quan gì đến tảo , ngoài khả năng quang hợp hiếu khí (quang tự dưỡng vô cơ) và dùng H2O làm chất cho điện tử trong quá trình quang hợp. Vi khuẩn lam chứa chlorophyll a và phycocyanin- phycobiliprotein. Một số loài có sắc tố đỏ phycoerythrin. Chúng phối hợp với sắc tố lục tạo nên màu nâu. Màng liên kết với phycobilisom. Đơn bào hoặc đa bào dạng sơi. Không di động hoặc di động bằng cách trườn (gliding), một số loài có túi khí (gas vesicles).Nhiều loại có dị tế bào (heterocysts) và có khả năng cố định nitơ. Vi khuẩn lam có mặt ở khắp mọi nơi, trong đất, trên đá, trong suối nước nóng, trong nước ngọt và nước mặn. Chúng có năng lực chống chịu cao hơn so với thực vật đối với các điều kiện bất lợi như nhiệt độ cao, pH thấp. Một số loài có khả năng sống cộng sinh với các cơ thể khác như Rêu, Dương xỉ, Tuế...Nhiều loài cộng sinh với nấm để tạo ra Địa y (Lichen). Vi khuẩn lam có thể là sinh vật xuất hiện sớm nhất trên Trái đất Vi khuẩn lam được chia thành 5 nhóm (subsection) như sau: a- Nhóm I (có tác giả gọi là bộ Chroococcales): Hình que hoặc hình cầu đơn bào, không có dạng sợi hay dạng kết khối (aggregate); phân đôi hoặc nẩy chồi; không có dị tế bào (heterocytes). Hầu hết không di động. Tỷ lệ G+C là 31-71% . Các chi tiêu biểu là: -Chamaesiphon -Chroococcus -Gloeothece -Gleocapsa -Prochloron Chamaesiphon Glooeothece Chroococcus Gleocapsa Prochloron b-Nhóm II (có tác giả gọi là bộ Pleurocapsales): Hình que hoặc hình cầu đơn bào. có thể tạo dạng kết khối (aggregate); phân cắt nhiều lần tạo ra các baeocytes; không có dị tế bào.Chỉ có các baeocytes là có di động. Tỷ lệ G+C là 40-46% . Các chi tiêu biểu là:    -Pleurocapsa -Dermocapsa -Chroococcidiopsis Pleurocapsa Dermocapsa Chroococcidiopsis c-Nhóm III (có tác giả gọi là bộ Oscillatorriales): Dạng sợi (filamentous) ; dạng lông (trichome) không phân nhánh chỉ có ở các tế bào dinh dưỡng; phân đôi trên mặt phẳng, có kiểu đứt đoạn (fragmentation); không có dị tế bào; thường di động. Tỷ lệ G+C là 34-67%. Các chi tiêu biểu là:      -Lyngbya -Osscillatoria -Prochlorothrix -Spirulina -Pseudanabaena Lyngbya Oscillatoria Spirulina Prochlorothrix Pseudanabaena d-Nhóm IV (có tác giả gọi là bộ Nostocales) : Dạng sợi ; dạng lông (trichome) không phân nhánh có thể chứa các tế bào biệt hoá (specialized cell) ; phân đôi trên mặt phẳng, có kiểu đứt đoạn tạo thành đoạn sinh sản (hormogonia) ; có tế bào dị hình ; thường di động có thể sản sinh bào tử màng dày (akinetes). Tỷ lệ G+C là 38-47%. Các chi tiêu biểu là :       -Anabaena -Cylindrospermum -Aphanizomenon -Nostoc -Scytonema -Calothrix Anabaena Anabaena trong Bèo hoa dâu Cylindrospermum Calothrix Nostoc Scytonema e-Nhóm V (có tác giả gọi là bộ Stigonematales) : Lông (trichome) dạng sợi, phân nhánh hoặc do các tế bào nhiều hơn một chuỗi tạo thành ; phân đôi theo nhiều mặt phẳng, hình thành đoạn sinh sản (hormogonia) ; có tế bào dị hình ; có thể sản sinh bào tử màng dày ( alkinetes), có hình thái phức tạp và biệt hóa (differentiation). Tỷ lệ G+C là 42-44%. Các chi tiêu biểu là :    -Fischerella -Stigonema -Geitlerinema Fischerella Geitlerinema Theo NCBT (2005) thì Vi khuẩn lam bao gồm những bộ sau đây:  -Chlorococcales  -Gloeobacteria  -Nostocales  -Oscillatoriales  -Pleurocapsales  -Prochlorales 2- Vi khuẩn sinh nội bào tử (Endospore-forming bacteria): A-Vi khuẩn hình cầu 2.1- Chi Sporosarcina AA-Vi khuẩn hình que B-Kỵ khí bắt buộc C-Sinh trưởng được ở nồng độ 3-12% NaCl 2,2- Chi Sporohalobacter CC-Không sinh trưởng được ở nồng độ 3-12% NaCl D-Khử sulfat 2.3- Chi Desulfotomaculum DD-Không khử sulfat E-Phân giải Axit 3-hydroxybenzoic 2.4- Chi Sporomaculum EE- Không phân giải Axit 3-hydroxybenzoic F- Chiều rộng của tế bào > 2,5mm 2.5- Chi Oscillosporia FF- Chiều rộng của tế bào < 2,5mm G-Sử dụng axit béo bão hoà và axit butyric 2.6- Chi Syntrophospora GG- Không sử dụng axit béo bão hoà 2.7- Clostridium BB- Vi hiếu khí 2.8-Sporolactobacillus BBB- Hiếu khí và kỵ khí không bắt buộc C- Phân giải lignin trên môi trường kiềm 2.9- Amphibacillus CC- Không phân giải lignin trên môi trường kiềm D-Sinh trưởng trên môi trường > 10% NaCl 2.10- Halobacillus DD-Không sinh trưởng trên môi trường > 10% NaCl E-Có thể phân giải Thiamin 2.11- Aneurinibacillus EE- Không có thể phân giải Thiamin F-Có chứa acid béo vòng w trong lipid 2.12- Alicycolobacillus FF- Không chứa acid béo vòng w G- Có thể tạp giao với 515F (chạy PCR) 2.13- Paenibacillus GG- Không thể tạp giao với 515F H- Có thể tạp giao với 1741F (chạy PCR) 2.14- Brevibacillus HH- Không thể tạo giao với 1741F I-Phân giải quặng pyrit 2.15- Sulfidobacillus II- Không phân giải quặng pyrit 1.16- Bacillus Sporosarcina Desulfotomaculum Paenibacillus Clostridium Bacillus 3- Trực khuẩn Gram âm, lên men , hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc A- Catalase dương tính, không di động hay di động nhờ tiên mao ở cực B- Thường di động nhờ tiên mao ở cực, không ký sinh ở động vật có xương sống Họ Vibrionaceae 3.1- Chi Aeromonas 3.2- Chi Enhydrobacter 3.3- Chi Photobacterium 3.4- Chi Pleisiomonas 3.5- Chi Vibrio BB- Không di động, ký sinh ở động vật có xương sống Họ Pasteurellaceae 3.6- Chi Actinobacillus 3.7- Chi Haemophilus 3.8-Chi Pasteurella AA- Catalase âm tính, không di động hay di động nhờ chu mao Họ Enterobacteriaceae 3.9- Chi Proteus 3.10-Chi Enterobacter 3.11-Chi Pantoea 3.12-Chi Rhanella ` 3.13-Chi Providencia 3.14-Chi Morganella 3.15-Chi Tatumella 3.16-Chi Salmonella 3.17-Chi Edwardisiella 3.18-Chi Citrobacter 3.19-Chi Budvicia 3.20-Chi Pragia 3.21-Chi Leminorella 3.22-Chi Serratia 3.23-Chi Xenorhabdus 3.24-Chi Klebsiella 3.25-Chi Kluyvera 3.26-Chi Yersinia 3.27-Chi Cedecea 3.28-Chi Ewingella 3.29-Chi Buttiauxella 3.30-Chi Moellerlla 3.31-Chi Leclecia 3.32-Chi Escherichia 3.33-Chi Yokenlla 3.34-Chi Hafnia 3.35-Chi Tatumella Aeromonas Vibrio Photobacterium Actinobacillus Vibrio Proteus Pasteurella Morganella Citrobacter Pasteurella Enterobacter Salmonella Salmonella Serratia Yersinia Serratia Klebsiella Klebsiella Escherichia 4-Trực khuẩn Gram âm , không lên men , hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc A- Sinh trưởng được ở 60°C B-Tế bào lớn, chiều rộng 1,3-1,8mm 4.1- Chi Thermomicrobium BB-Tế bào nhỏ, chiều rộng 0,4-0,8mm C-Có thể dùng glucose làm nguồn carbon D-Sinh trưởng được ở pH 4,5 4.2- Chi Acidothermus DD-Không sinh trưởng được ở pH 4,5 4.3- Chi Thermus CC-Không thể dùng glucose làm nguồn carbon duy nhất 4.4- Chi Thermoleophilum AA- Không sinh trưởng được ở 60°C B-Có thể oxy hoá etanol thành axit axetic C-Có thể oxy hoá etanol tới CO2 và H2O D-Có thể oxy hoá acid DL-lactic tới CO2 và H2O 4.5- Chi Acetobacter DD-Không oxy hoá acid DL-lactic tới CO2 và H2O 4.6- Chi Acidomonas CC-Không thể oxy hoá ethanol tới CO2 và H2O D-Có thể oxy hoá acid DL-lactic tới CO2 và H2O 4.7- Chi Frateuria DD-Không oxy hoá acid DL-lactic tới CO2 và H2O 4.8- Chi Gluconobacter BB-Không oxy hoá etanol thành acid acetic C-Có thể cố định Nitơ ngoài cơ thể D-Có thể cố định Nitơ trong điều kiện hiếu khí E-Có thể sinh bào xác (cysts) 4.9-Chi Azotobacter EE-Không sinh bào xác F-Có lipoid trong phần cực của tế bào 4.10-Chi Beijerinckia FF-Không có lipoid trong phần cực tế bào G-Tế bào rộng > 2,0mm 4.11- Chi Azomonas GG- Tế bào rộng < 2,0mm 4.12- Chi Derxia DD- Có thể cố định nitơ trong điều kiện vi hiếu khí E-Tiên mao thường mọc ở cực F-Trong đất, có thể trao đổi carbohydrat 4.13- Chi Agromonas FF-Trong nước, không trao đổi carbohydrat 4.14-Loài Aquaspirillum fasciculus EE-Chu mao F-Sinh trưởng và cố định nitơ ở pH < 3,0 4.5- Loài Acetobacter diazotrophicus FF-Không sinh trưởng và cố định nitơ ở pH < 3,0 4.15- Chi Xanthobacter CC- Không thể cố định nitơ ngoài cơ thể D-Hình thành nốt sần trong rễ, trong thân thực vật, có thể không khí. cố định nitơ từ E-Sinh acid trên môi trường Thạch-Cao nấm men-Mannit F-Có thể dùng DL-Arginin, L-Histidin làm nguồn nitơ duy nhất. 4.16- Chi Rhizobium FF- Không thể dùng DL-Arginin , L-Histidin làm nguồn nitơ duy nhất 4.17- Chi Sinorhizobium EE-Không sinh acid trên môi trường Thạch- Cao nấm men- Mannit F-Có Dihydrolase arginin và Decarbocylase lysin 4.18- Chi Azorhizobium FF-Không có Dihydrolase arginin và Decarboxylase lysin 4.19-Chi Bradyrhizobium DD- Không sinh nốt sần trong cơ thể để cố định nitơ E- Sinh khối u ở rễ thực vật 4.20- Chi Agrobacterium EE- Không sinh khối u ở rễ thực vật F-Cố định nitơ ở mặt lá 4.21- Chi Phyllobacterium FF-Không cố định nitơ ở mặt lá G-Có thể dùng hợp chất 1 carbon làm H-Có tích luỹ PHB trong tế bào nguồn carbon duy nhất I-Gây bệnh thực vật 4.22-Chi Rhizobacter II- Không gây bệnh thực vật J-Không di động 4.23- Loài Paracoccus denitrificans/ Paracoccus alcaliphalus JJ-Di động K-Nhuộm Gram dương tính hoặc khả biến 4.15- Chi Xanthobacter KK- Không như trên 4.24- Chi Methylobacter HH-Không tích luỹ PHB trong tế bào I-Có thể dùng methane làm nguồn carbon duy nhất K-Di động 4.25- Chi Methylomonas KK-Không di động 4.26-Chi Methylococcus II- Không thể dùng methane làm nguồn C duy nhất J-Catalase dương tính K-Sinh trưởng cần NaCl 4.27- Chi Methylophaga KK- Sinh trưởng không cần NaCl 4.28- Chi Methylophilus JJ-Catalase âm tính 4.29- Chi Methylobacillus GG- Không thể dùng hợp chất 1 carbon làm nguồn carbon duy nhất H-Sinh trưởng cần NaCl hay nước biển I- Không di động 4.30- Chi Mesophilobacter II- Di động J-Có gelatinase 4.31- Chi Alteromonas JJ-Không có gelatinase K-Có tích luỹ PHB L-Sử dụng glucose M-Có esterase 4.32- Chi Deleya MM-Không có esterase 4.33- Loài Oceanospirillum kriegii LL- Không sử dụng glucose 4.33- Loài Oceanospirillum jannaschii KK- Không tích luỹ PHB L- Sinh axít từ mannit 4.34- Chi Marinomonas LL- Không sinh axít từ mannit 4.36- Chi Pseudomonas (P.stanieri, P.perfectomarina, P.doudoroffii, P.nautica) HH- Sinh trưởng không cần NaCl hay nước biển I- Có tự dưỡng hydrogen J-Có tiên mao ở cực hay gần cực K-Khuẩn lạc màu vàng L-Không sinh trưởng ở 520C 4.35- Chi Hydrogenophaga LL- Sinh trưởng ở 520C 4.36- Loài Ps. hydrogenothermophila KK- Khuẩn lạc không màu vàng 4.36- Chi Pseudomonas (P. saccharophila, P.facillis, P.hydrogenovora) JJ- Có chu mao thưa 4.50- Chi Alcaligenes (A.paradoxus, biovar, A.eutrophus, A.latus, A.denitrificans subsp. xylosoxidans) II- Không có tự dưỡng hydrogen J- Di động K- Tiên mao mọc ở cực L-Catalase dương tính 4.36~47 –Chi Pseudomonas LL-Catalase âm tính 4.48- Chi Xanthomonas KK- Chu mao L-Sinh acid từ đường 4.49- Chi Ochrobactrum LL-Không sinh acid từ đường 4.50- Chi Alcaligenes JJ- Không di động K-Khuẩn lạc màu vàng L-Phospholipid chứa sphingosin 4.51- Chi Sphingobacterium LL-Phospholipid không chứa sphingosin 4.52- Flavobacterium KK- Khuẩn lạc không có màu vàng L- Yêu cầu chặt chẽ về dinh dưỡng M-Lượng chứa G+C cao (66-70mol%) 4.53- Chi Bordetella MM- Lượng chứa G+C thấp (40-47mol%) N-Sinh trưởng mạnh 4.54- Chi Moraxella NN- Sinh trưởng yếu 4.55- Chi Oligella LL-Không yêu cầu chặt chẽ về dinh dưỡng M- Khuẩn lạc màu tím 4.56- Chi Chromobacterium MM- Khuẩn lạc không có màu tím N-Catalase dương tính O-Hình que có lúc biến hình cầu 4.57- Chi Acinetobacter OO- Không biến thành hình cầu 4.58- Chi Weeksella NN-Catalase âm tính O- Sinh indol 4.59- Chi Suttonella OO- Không sinh indol 4.60- Chi Kingella Thermomicrobium Thermus Thermoleophilum Acetobacter Gluconobacter Bordetella Azotobacter Rhizobium Methylobacterium và nốt sần trên rễ Sinorhizobium Methylococcus Agrobacterium Alcaligenes và nốt sần trên rễ Bradyrhizobium và nốt sần Flavobacterium và nốt sần trên rễ Pseudomonas và khuẩn lạc Moraxella Chromobacterium Acinetobacter 5- Cầu khuẩn Gram âm, kỵ khí bắt buộc A- Đường kính tế bào > 1,3µm 5.1- Chi Megasphaera AA- Đường kính tế bào < 1,3µm B- Khuẩn lạc dưới tia tử ngoại (360nm) có màu đỏ huỳnh quang, chỉ sinh acid béo 2 carbon 5.2- Chi Syntrophococcus BB- Khuẩn lạc dưới tia tử ngoại (360nm) không có màu đỏ huỳnh quang, có thể sinh cả các acid béo khác C- Aminoacid là nguồn năng lượng chủ yếu, không lên men lactic 5.3- Chi Acidaminococcus CC- Aminoacid không phải là nguồn năng lượng chủ yếu, lên men lactic 5.4- Chi Veillonella Megasphaera Acidaminococcus Veillonella 6-Trực khuẩn, phẩy khuẩn, xoắn khuẩn Gram âm, kỵ khí : I- Sinh trưởng ở nhiệt độ ≥ 550 C A-Không lên men và đồng hoá carbohydrat , sử dụng peptid, aminoacid, cao nấm men... B- Tế bào có bao, không khử Fe3+. 6.1- Chi Thermosipho BB- Tế bào không có bao C-Sử dụng các loại acid hữu cơ và H2 để khử Fe3+ 6.2- Chi Deferribacter CC-Không khử Fe3+ 6.3- Chi Thermosyntropha AA-Lên men và đồng hoá carbohydrat B-Ưa mặn. sinh trưởng ở nồng độ NaCl ≥ 4% C-Di động nhờ chu mao, sản phẩm lên men chủ yếu là acid acetic, ethanol, H2/CO2 6.4- Chi Halothermothrix CC- Di động nhờ tiên mao mọc bên cạnh hay gần cực tế bào, sản phẩm lên men chủ yếu là acid acetíc, acid lactic, acid succinic, H2/CO2 6.5- Chi Thermotoga BB- Không ưa mặn, không sinh trưởng ở nồng độ NaCl ≥ 4% C-Sản phẩm lên men chỉ là acid acetic D-Thành tế bào điển hình Gram âm, cần vitamin B12 6.6- Chi Acetothermus DD-Thành tế bào không điển hình Gram âm, cần H2S hoặc Cystein 6.7- Chi Acetogenium CC-Sản phẩm lên men là hỗn hợp acid acetic và các acid hữu cơ khác D-Di động E-Phẩy khuẩn, di động nhờ tiên mao mọc ở bên hay gần cực 6.8- Chi Acetomicrobium EE-Hình que hoặc biến đổi,không di động hoặc di động nhờ chu mao 6.9- Chi Fervidobacterium DD-Không di động E-Sản phẩm lên men gồm H2/CO2 và hỗn hợp acid F-Sản phẩm lên men gồm acid acetíc, ethanol, H2/CO2 6.10- Chi Thermohydrogenum FF-Sản phẩm lên men gồm acid acetic và ethanol, hoặc acid acetic và H2/CO2 6.11- Chi Coprothermobacter EE-Không sinh khí, sản phẩm lên men gồm acid acetic, acid propionic, acid isopentanoic 6.12- Chi Anaerobaculum II- Không sinh trưởng ở nhiệt độ ≥ 550 C, ưa ấm A- Không đồng hóa và lên men carbohydrat B-Không nuôi dưỡng được thuần khiết, phải nuôi chung với một vi khuẩn khác, phân giải các đoạn axít béo ngắn C-Tế bào hình que hay hình sợi dài, sản phẩm phân giải acid béo là acid acetic và H2 /CO2 6.13- Chi Syntrophobacter CC-Phẩy khuẩn, sản phẩm phân giải acid béo là acid acetic, acid propionic, acid isobutiric, acid isopentanoic và H2//CO2 6.14- Chi Syntrophomonas BB-Có thể nuôi cấy thuần khiết C-Chứa sắc tố tế bào, vi hiếu khí 6.15- Chi Wolinella CC- Không chứa sắc tố tế bào, kỵ khí bắt buộc D-Chỉ sử dụng acid succinic và chỉ sản sinh acid propionic E-Phẩy khuẩn, di động nhờ tiên mao mọc ở bên 6.16- Chi Schuartzia EE- Trực khuẩn, không di động 6.17- Chi Succinoclastium DD- Đồng hoá các loại protein E-Di động nhờ chu mao, không lên men hoặc lên men yếu glucose, sản phẩm là ethanol và acid butyric 6.18- Chi Tissierella EE- Không di động F- Trên đĩa thạch máu khuẩn lạc có màu từ nâu đến đen 6.19- Chi Porphyromonas FF- Trên đĩa thạch máu khuẩn lạc không có màu từ nâu đến đen, lên men pyridin và arginin 6.20- Chi Synergistes AA-Có thể đồng hoá và lên men hydrat carbon, sản sinh các loại axit hữi cơ 1. Sản phẩm chủ yếu lên men hydrat carbon là acid acetic hoặc acid acetic với ethanol và H2/CO2 B-Acid acetic là sản phẩm lên men duy nhất C- Di động nhờ chu mao 6.21- Chi Acetoanaerobium CC- Không di động D-Có thể lên men aminoacid, sinh indol từ tryptophan 6.22- Chi Acidaminobacter DD- Không lên men aminoacid, lên men carbohydrat và acid hữu cơ E- Sản phẩm lên men ngoài acid acetic còn có một ít acid formic và acid lactic 6.23- Chi Catonella EE-Sản phẩm lên men ngoài acid acetic còn có một ít acid isopentanoic, acid lactic, acid succinic, acid isobutyric và acid butyric 6.24- Chi Johngonella BB- Sản phẩm lên men gồm có acid acetic, ethanol và H2/CO2 C-Trực khuẩn hoặc phẩy khuẩn, di động D- Di động nhờ tiên mao mọc ở cực, không ưa mặn 6.25- Chi Acetovibrio DD- Di động nhờ chu mao, ưa mặn 6.26- Chi Haloanaerobacter CC- Tế bào dạng sợi, không di động 6.27- Chi Acetofilamentum 2- Sản phẩm chủ yếu lên men carbohydrat là acid lactic hoặc acid lactic , acid acetic và các acid khác B-Di động, ưa mặn 6.28- Chi Halocella BB- Không di động, không ưa mặn C-Sản phẩm lên men chỉ có acid lactic 6.29- Chi Leptotrichia CC- Sản phẩm lên men gồm acid lactic và các acid khác D-Sản phẩm lên men là acid lactic và acid acetic E- Tế bào phình to ở giữa, không sinh khí 6.30- Chi Sebaldella EE- Tế bào hình cong, sinh khí 6.31- Chi Lachnospira DD- Sản phẩm lên men là acid lactic, acid acetic và acid succinic E- Tế bào lớn, đường kính tới 3mm 6.32- Chi Megamonas EE- Tế bào < 1,5mm 6.33-Chi Mitsuokella 6.34- Chi Halella 3-Sản phẩm chủ yếu lên men carbohydrat là acid propionic hoặc acid propionic và các acid khác B-Sản sinh acid hữu cơ và H2/CO2 C-Không di động, ưa mặn, cần NaCl ≥ 1% D- Chỉ sản sinh acid propionic và CO2 6.35- Chi Propionigenium DD- Ngoài acid propionic và CO2 còn có các acid khác E- Sản sinh acid propionic, CO2 ,acid acetic và ethanol 6.36- Chi Pelobacter EE- Sản sinh acid propionic, CO2 , acid aceic và acid butyric 6.37- Chi Haloanaerobium CC- Di động, không ưa mặn D-Tế bào hình cong, di động nhờ tiên mao ở cực hay ở bên E- Đường kính tế bào ≥ 0.9mm 6.38- Chi Selenomonas EE- Đường kính tế bào 0,5mm 6.39- Chi Anaerovibrio DD-Tế bào hình cong hay hình xoắn, di động nhờ chu mao 6.40- Chi Propionispira BB- Sản sinh hỗn hợp acid, acid propionic là chính, không sinh khí C-Chủ yếu sản sinh acid propionic D-Tế bào hình que 6.41- Chi Oribaculum DD-Tế bào cong hình thân rắn 6.42- Chi Centipeda CC-Sản sinh acid propionic, acid acetic và acid succinic D-Di động E- Tiên mao dạng lược mọc bên, tế bào hình cong 6.43- Chi Pectinatus EE-Tế bào dạng cong hoặc dạng xoắn 6.44- Chi Zymophilus DD- Không di động E-Đường kính tế bào ≥ 3mm 6.32- Chi Megamonas EE- Đường kính tế bào < 3m F-Tế bào hình que, chỉ sản sinh acid propionic và acid acetic 6.45 – Chi Anaerorhabdus FF- Tế bào hình biến đổi, sản sinh acid propionic và các acid khác G-Tế bào nhỏ, đầu nhọn, sản sinh acid propionic và acid succinic 6.46- Chi Rikenella GG- Kích thước tế bào thay đổi, sản sinh acid propionic, acid formic, acid acetic, acid lactic, và acid succinic 6.47- Chi Bacteroides 4- Sản phẩm chủ yếu lên men carbohydrat là acid butyric hoặc acid butyric và các acid khác B-Di động nhờ tiên mao mọc ở cực hay gần cực, tế bào hình cong C- Sản phẩm lên men chỉ là acid butyric D- Di động 6.48- Chi Pseudobutyrivibrio DD- Không di động 6.49- Chi Fusobacterium CC-Ngoài acid butyric còn có các sản phẩm lên men khác D-Sản sinh acid butyric và CO2 6.50- Chi Roseburia DD-Sản sinh acid butyric, acid acetic hoặc acid lactic, không sinh khí 6.51- Chi Butyrivibrio BB-Di động nhờ chu mao hoặc không di động C- Sản sinh acid butyric, acid acetic và ethanol, không sinh khí, cần 1% NaCl 6.52- Chi Iliobacter CC-Sản sinh acid butyric, acid acetic...và có sinh khí, cần 13% NaCl 6.37- Chi Haloanaerobium 5-Sản phẩm lên men carbohydrat là hỗn hợp acid có chứa acid succinic hoặc acid formic B- Sản sinh hỗn hợp acid có chứa acid formic C-Sản sinh axit formic và CO2 6.53- Chi Oxalobacter CC-Sản sinh acid formic và các acid khác nhưng không sinh CO2 D-Tế bào hình que, sản sinh acid formic, acid acetic và acid succinic 6.54- Chi Ruminobacter DD- Tế bào hình dạng thay đổi, sản sinh acid formic, acid acetic, acid succinic, acid lactic và acid propionic 6.47- Chi Bacteroides BB-Sản sinh hỗn hợp acid có chứa acid succinic C- Di động D-Tế bào hình que ngắn, chỉ sản sinh acid succinic 6.55- Chi Succinimonas DD- Tế bào hình cong, sản sinh hỗn hợp acid có chứa acid succinic E-Sản sinh acid succinic, acid acetic và có sinh CO2 6.56- Chi Malonomonas EE- Sản sinh acid succinic, acid acetic, không sinh CO2 6.57- Chi Succinovibrio CC- Không di động D-Sản sinh acid acetic, acid lactic và acid succinic 6.33- Chi Mitsuokella DD-Trong hỗn hợp acid không có acid lactic E-Sản sinh acid propionic và acid succinic 6.46- Chi Rikenella EE- Sản sinh acid acetic và acid succinic F- Tế bào hình xoắn, di động 6.58- Chi Anaerobiospirrillum FF- Không di động G-Tế bào hình que ngắn, chủ yếu sống ở dạ cỏ và manh tràng 6.59- Chi Fibrobacter GG- Tế bào đa hình thái, chủ yếu sống ở khoang miệng 6.60- Prevotella Thermosipho Wolinella Syntrophobacter nuôi cấy chung với Methanobrevibacte Porphyromonas gingivalis vệt cấy trên thạch máu Leptotrichia Fusobacterium Bacteroides Fusobacterium Bacteroides Mitsuokella 7- Cầu khuẩn Gram dương hiếu khí và kỵ khí không bắt buộc A- Hiếu khí B-Di động C-Ưa mặn bắt buộc, cần NaCl 7,5% 7.1- Chi Marinococcus CC-Không như trên 7.2- Chi Planococcus BB-Không di động C-Ưa mặn, cần NaCl 7,5% D- Lượng chứa GC > 50mol % 7.3- Chi Salinicoccus DD- Lượng chứa GC < 50mol % 7.1- Chi Marinococcus CC-Không như trên D-Sinh acid từ glucose 7.4- Chi Micrococcus DD-Không sinh hay sinh ít acid từ glucose 7.5- Chi Deinococcus AA- Kỵ khí không bắt buộc B-Tỷ lệ G + C trong ADN < 30mol % 7.6- Chi Melissococcus BB- Tỷ lệ G + C trong ADN > 50mol % 7.7- Chi Stomatococcus BBB- Tỷ lệ G + C trong ADN > 30 mol % , nhưng < 50mol % C- Catalase (+) D- Thành tế bào chứa acid teichoic 7.8- Chi Staphylococcus DD- Thành tế bào khôngchưá acid teichoic 7.9- Chi Saccharococcus CC- Catalase (-) D- Ngoài xếp thành đôi còn có dạng xếp thành bốn E- Đề kháng với Vancomycin (30mg) 7.10- Chi Pediococcus EE- Không đề kháng với Vancomycin 7.11- Chi Aerococcus DD- Không có dạng xếp thành bốn E-Xếp thành chuỗi rất dài 7.12- Chi Trichococcus EE- Không xếp thành chuỗi dài F-Sinh trưởng ở 10°C G- Sinh khí từ glucose 7.13- Chi Leuconostoc GG- Không sinh khí từ glucose H- Sinh trưởng ở 45°C 7.14- Chi Enterococcus HH- Không sinh trưởng ở 45°C I-Di động, sống trong nước 7.15- Chi Vagococcus II- Không di động 7.16- Chi Lactococcus FF- Không sinh trưởng ở 10°C G-Lượng chứa G + C của ADN>35mol % 7.17- Chi Streptococcus GG-Lượng chứa G + C của ADN< 35mol % 7.18- Chi Gemella Micrococcus Deinococcus Deinococcus Melissococcus Staphylococcus Melissococcus Staphylococcus Khuẩn lạc Stomatococcus Pediococcus Aerococcus Enterococcus Streptococcus Leuconostoc Lactococcus Streptococcus Leuconostoc Lactococcus Gemella 8- Trực khuẩn Gram dương hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc A-Hiếu khí B-Có chu kỳ biến hoá hình cầu, hình que C-Thành tế bào có chứa DAP (acid diaminopimelic) D- Có chứa LL-DAP E-Di động 8.1- Chi Pimelobacter EE- Không di động 8.2- Chi Terrabacter DD- Không chứa dạng LL- mà chứa dạng Meso-DAP E-Loại quinone là MK-8 (H2), MK-7 (H2) 8.3- Chi Brevibacterium EE-Không như trên 8.4- Chi Brachybacterium CC- Peptidoglycan không chứa DAP D-Hình que không quy tắc 8.5- Chi Arthrobacter DD-Hình que có quy tắc 8.6- Chi Kurthia BB- Không có biến hoá hình cầu, hình que C-Có chứa acid mycolic 8.7- Chi Caseobacter CC-Không chứa axít mycolic D-Sắp xếp thành hình chữ V E- Peptidoglycan có chứa D-ornitin, quinone là MK-11,MK-12 8.8- Chi Aureobacterium EE- Peptidoglycan chứa L-ornitin, quinone là MK-8 8.9- Chi Sphaerobacter DD-Tế bào không sắp xếp thành hình chữ V E- Hình que không quy tắc F-Không có dạng tế bào hình cầu hay hình que ngắn G- Quinone là MK-8 8.10- Chi Rubrobacter GG- Không như trên H- Peptidoglycan chứa D-ornitin 8.11- Chi Curtobacterium HH- Không như trên 8.12- Chi Clavibacter FF-Có dạng tế bào hình cầu hay hình que ngắn G-Peptidoglycan chứa DAP 8.13- Chi Aeromicrobium GG-Peptidoglycan không chứa DAP 8.14- Chi Microbacterium EE- Hình que có quy tắc 8.15- Chi Renibacterium AA- Kỵ khí không bắt buộc B-Catalase (+) C- Có chứa DAP D-Có acid mycolic 8.16- Chi Corynebacterium DD- Không có acid mycolic E-Sản sinh acid propionic 8.17- Chi Propionibacterium EE- Không sản sinh acid propionic F-Hình que không quy tắc 8.18- Chi Dermabacter FF-Hình que có quy tắc G-Chiều rộng vi khuẩn > 1,0mm 8.19- Chi Caryophanon GG- Chiều rộng vi khuẩn < 1,0mm H-Gây bệnh ở động vật 8.20- Chi Listeria HH- Không gây bệnh ở động vật 8.21- Chi Brochothrix CC-Không chứa DAP D-Peptidoglycan chứa lysin E- Di động F- Quinone là MK-7 8.22- Chi Exiguobacterium FF- Quinone là MK-9 8.23 – Chi Jonesia EE- Không di động 8.24- Chi Rothia DD – Peptidoglycan không chứa lysin E- Phân giải cellulose 8.25- Chi Cellulomonas EE- Không phân giải cellulose 8.26- Chi Rarobacter BB- Catalase (-) C-Peptidoglycan thuộc nhóm B (theo Schleiter và Kandier,1972) D- Hình que không quy tắc 8.27- Chi Agromyces DD- Hình que có quy tắc E- Thường có dạng hình sợi 8.28- Chi Erysipelothrix EE-Không có dạng hình sợi 8.29- Chi Carnobacterium CC-Peptidoglycan không thuộc nhóm B mà thuộc nhóm A D-Hình que không quy tắc E- Peptidoglycan chứa LL-DAP 8.30- Chi Arachnia EE- Peptidoglycan không chứa LL-DAP F-Không có menaquinone 8.31- Chi Gardnerella FF- Có menaquinone G-Có menaquinone MK-10 (H4) 8.32- Chi Actinomyces GG- Có menaquinone MK-9 (H4) 8.33 - Chi Arcanobacterrium DD- Hình que có quy tắc 8.34- Chi Lactobacillus Brevibacterium Rubrobacter Arthrobacter Aeromicrobium Arthrobacter Renibacterium Corynebacterium Cellulomonas Actinomyces Propionibacterium Cellulomonas Lactobacillus Listeria Agromyces Lactobacillus 9- Trực khuẩn không quy tắc, không bào tử A- Gram (+) B- Ưa nhiệt C- Tế bào có phân nhánh D-Ưa kiềm 9.1- Chi Anaerobranca DD- Không ưa kiềm 9.2- Chi Thermobrachicum CC- Tế bào không phân nhánh D-Di động 9.3- Chi Thermoanaerobacter DD-Không di động 9.4- Chi Thermoanaerobium BB-Ưa ấm C-Tế bào hình bâù dục, hình que ngắn hay hình cong D- Tế bào nhỏ nhọn hình con, sắp xếp từng đôi hình lưỡi liềm 9.5- Chi Falcivibrio DD- Tế bào hình bầu dục, hình que ngắn, không sắp xếp thành hình lưỡi liềm E-Lên men hydrat carbon chỉ sản sinh acid acetic, còn có thể acetic từ H2 và CO2 tổng hợp ra acid F- Thích hợp sinh trưởng ở 30°C 9.6- Chi Acetobacterium FF-Thích hợp sinh trưởng ở 38°C 9.7- Chi Acetitomaculum EE- Lên men hydrat carbon sinh acid lactic, không tổng hợp ra acid acetic từ H 2 và CO2 9.8- Chi Atopobium CC-Tế bào hình que không quy tắc D-Tế bào có phân thành hình nĩa (đinh ba), lên men hydrat carbon không sinh khí 9.9- Chi Bifidobacterium DD- Tế bào không phân thành hình nĩa, lên men hydrat carbom có sinh khí E-Sản phẩm lên men chủ yếu là acid butyric, acid acetic hoặc acid formic. 9.10- Chi Eubacterium EE- Sản phẩm lên men chủ yếu là acid acetic, acid lactic và etanol 9.11- Chi Coribacterium AA- Gram (-) A- Tế bào hình que, ưa nhiệt, không di động 9.12- Chi Acetogenium BB- Tế bào dạng cong hay dạng sợi, di động C-Lên men hydrat carbon sản phẩm chủ yếu là acid butyric 9.13- Chi Butyrivibrio CC-Lên men hydrat carbon sản phẩm chủ yếu không là acid butyric D-Lên men glucose, sản phẩm chủ yếu là acid acetic và acid lactic, không sinh khí 9.14- Chi Mobiluncus sinh khí DD- Lên men glucose, sản sinh acid formic, acid acetic, acid lactic và etanol, có 9.15- Chi Lachnospira Thermoanaerobacter dưới kính hiển vi điện tử Bifidobacterium Eubacterium Mobiluncus 10- Cầu khuẩn Gram dương kỵ khí bắt buộc A- Tế bào phân cắt theo 3 mặt phẳng thẳng góc, sắp xếp thành hình lập thể 10.1- Chi Sarcina AA- Tế bào phân cắt theo 1 hoặc 2 mặt phẳng thẳng góc , sắp xếp thành từng đôi hay từng 4 tế bào B-Không lên men hydrat carbon, không sinh khí C- Tỷ lệ G + C mol % trong ADN ≥ 50 10.2- Chi Peptococcus CC- Tỷ lệ G + C mol % trong ADN  45 10.3- Chi Peptostreptococcus BB- Lên men hydrat carbon sinh acid C-Trong sản phẩm lên men ngoài các acid hữu có khác còn có acid butyric và aceton (acetone) 10.4- Chi Coprococcus CC- Trong sản phẩm lên men không có acid butyric và aceton 10.5- Chi Ruminococcus Peptostreptococcus Peptostreptococcus Ruminococcus 11- Phân loại xạ khuẩn Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn đặc biệt. Chúng có khuẩn lạc khô và đa số có dạng hình phóng xạ (actino-) nhưng khuẩn thể lại có dạng sợi phân nhánh như nấm (myces). Vì xạ khuẩn có cấu trúc nhân nguyên thuỷ như mọi vi khuẩn khác, chiều ngang của sợi cũng nhỏ như vi khuẩn, cho nên có tài liệu gọi chúng là nấm tia là không hợp lý. Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Số lượng đơn vị sinh khuẩn lạc (CFU- colony-forming unit) xạ khuẩn trong 1g đất thường đạt tới hàng triệu. Trên môi trường đặc đa số xạ khuẩn có hai koại khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh (aerial mycelium) và khuẩn ty cơ chất (substrate mycelium). Nhiều loại chỉ có khuẩn ty cơ chất nhưng cũng có loại (như chi Sporichthya) lại chỉ có khuẩn ty khí sinh. Giữa khuẩn lạc thường thấy có nhiều bào tử màng mỏng gọi là bào tử trần (conidia hay conidiospores). Nếu bào tử nằm trong bào nang (sporangium) thì được gọi là nang bào tử hay bào tử kín (sporangiospores). Bào tử ở xạ khuẩn được sinh ra ở đầu một số khuẩn ty theo kiểu hình thành các vách ngăn (septa). Các chuỗi bào tử trần có thể chỉ là 1 bào tử (như ở Thermoactinomyces, Saccharomonospora, Promicromonospora, Micromonospora, Thermomonosspora...),có thể có 2 bào tử (như ở Microbispora), có thể là chuỗi ngắn (như ở Nocardia, Pseudonocardia, Streptoverticillium, Actinomadura, Sporichthya, Microtetraspora, Streptoalloteichus, Glycomyces, Amycolata, Amycolatopsis, Catellatospora, Microellobosporia...), có thể là chuỗi dài (như ở Streptomyces, Saccharopolyspora, Saccharothrix, Actinopolyspora, nhiều loài ở Kibdelosporangium, Nocardia, Nocardioides, Kitasatosporia, Pseudonocardia, Amycolatopsis, Streptoverticillium...), có thể các bào tử trần nằm trên bó sợi (synnema), tương tự bó sợi của nấm (như ở Actinosynnema, Actinomadura...). Các chuỗi bào tử có thể thẳng, có thể xoắn, có thể ở dạng lượn sóng, có thể mọc đơn hay mọc vòng... Các cuống sinh bào tử (sporophore) và cuống sinh nang bào tử (sporangiophorres) có thể riêng rẽ, có thể phân nhánh. Các đặc điểm hình thái này rất quan trọng khi tiến hành định tên xạ khuẩn. Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, thường có tỷ lệ GC trong ADN cao hơn 55%. Trong số khoảng 1000 chi và 5000 loài sinh vật nhân sơ đã công bố có khoảng 100 chi và 1000 loài xạ khuẩn. Xạ khuẩn phân bố chủ yếu trong đất và đóng vai trò rất quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Chúng sử dụng acid humic và các chất hữu cơ khó phân giải khác trong đất. Mặc dù xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật nhân sơ nhưng chúng thường sinh trưởng dưới dạng sợi và thường tạo nhiều bào tử. Thậm chí một số loại xạ khuẩn còn hình thành túi bào tử như chi Streptosporangium, Micromonospora và bào tử di động như chi Actinoplanes, Kineosporia. Trước đây, vị trí phân loại của Xạ khuẩn luôn là câu hỏi gây nhiều tranh luận giữa các nhà Vi sinh vật học ,do nó có những đặc điểm vừa giống Vi khuẩn vừa giống Nấm. Tuy nhiên, đến nay, Xạ khuẩn đã được chứng minh là Vi khuẩn với những bằng chứng sau đây: 1. Một số xạ khuẩn như các loài thuộc chi Actinomyces và Nocardia rất giống với các loài vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus và Corynebacterium. 2. Xạ khuẩn giống vi khuẩn ở chỗ không có nhân thật, chúng chỉ chứa nhiễm sắc chất phân bố dọc theo các sợi hoặc các tế bào. 3. Đường kính của sợi xạ khuẩn và bào tử giống với ở vi khuẩn. Đồng thời sợi xạ khuẩn thường không chứa vách ngăn. 4. Xạ khuẩn là đích tấn công của các thực khuẩn thể giống như vi khuẩn, trong khi đó, nấm không bị tấn công bởi thực khuẩn thể. 5. Xạ khuẩn thường nhạy cảm với các kháng sinh có tác dụng lên vi khuẩn, nhưng lại thường kháng với những kháng sinh tác dụng lên nấm như các polyen. 6. Xạ khuẩn không chứa chitin, chất có mặt trong sợi và bào tử của nhiều nấm, mà không có ở vi khuẩn. Đồng thời giống như phần lớn vi khuẩn, xạ khuẩn không chứa cellulose. 7. Tương tự với vi khuẩn, xạ khuẩn nhạy cảm với phản ứng acid của môi trường, đặc điểm này không có ở nấm. 8. Các đặc điểm về sợi và nang bào tử kín(sporangium) của chi Actinoplanes cho thấy có thể chi này là cầu nối giữa vi khuẩn và các nấm bậc thấp. Xạ khuẩn thuộc về lớp Actinobacteria, bộ Actinomycetales, bao gồm 10 dưới bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài. Hiện nay, 478 loài đã được công bố thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc tất cả các chi còn lại và được xếp vào nhóm xạ khuẩn hiếm. Khuẩn lạc xạ khuẩn Khuẩn ty xạ khuẩn và bào tử Chuỗi bào tử trên cuống sinh bào tử dạng xoắn Bào tử xạ khuẩn Sự hình thành hai loại khuẩn ty sau khi bào tử xạ khuẩn nẩy mầm Sợi bào tử và chuỗi bào tử trần Một số dạng bào tử ở xạ khuẩn (SV tự chú thích từng hình) Một số dạng nang bào và nang bào tử ở xạ khuẩn Một số dạng chuỗi bào tử ở xạ khuẩn (SV tự chú thích từng hình) Đặc điểm của khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất được trình bày trong sơ đồ sau đây: Để phân loại xạ khuẩn người ta sử dụng các tiêu chuẩn như trình tự rADN 16S, lai ADN, hình thái, sinh lý sinh hóa và hóa phân loại. Hiện nay, đại đa số các nhà khoa học đồng ý với quan niệm hai chủng được coi là hai loài riêng biệt nếu chúng giống nhau dưới 70% khi tiến hành lai ADN. Keswani và cộng sự đã chứng minh rằng nếu sự tương đồng giữa hai trình tự rADN 16S là 98.6% thì xác suất để mức độ giống nhau trong phép lai ADN thấp hơn 70% sẽ là 99%. Vì thế giá trị tương đồng 98.6% của trình tự rADN 16S được coi là ngưỡng để phân biệt hai loài khác nhau. Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá trị này là 98%. Đặc biệt hóa phân loại là rất quan trọng trong việc phân loại xạ khuẩn. Chúng rất có ích trong phân loại ở mức độ đến chi. Đó là những đặc điểm sau: đường, loại acetyl, acid mycolic trong thành tế bào, menaquinone, phospholipid, acid béo và tỷ lệ GC trong ADN. 1= Chi; 2=Loại thành tế bào ; 3=Thành phần đường ; 4=Loại peptido glycan ; 5=Acid mycolic 6=Thành phần acid béo ; 7=Mena quinon chủ yếu ; 8=Loại phospho-lipid ; 9=Tỷ lệ mol GC trong ADN (%) 1 2 3 4 5 6 8 7 9 Họ Corynebacteriaceae và một số họ liên quan Corynebacterium IV A Turicella IV A Gordonia IV A Williamsia IV Skermania A1γ 1a 8(H2), 9(H2) - 1b 10,11 + 1b 9(H2) PII 6369 A + 1b 9(H2) PII 6465 IV A + 1b 8(H4) PII 68 Dietzia IV A + 8(H2) PII 73 Mycobacterium IV A A1γ + 9(H2) PII 6270 Nocardia IV A A1γ + 1b 8(H4) PII 6472 Rhodococcus IV A A1γ + 1b 8(H2), 9(H2) PII 6069 Tsukamurella IV A A1γ + 9 PII 6673 A1γ PI 5167 + 6572 Họ Micromonosporaceae Micromonospora II D A1γ’ - 3b 9(H4.6), 10(H4,6) PII 7172 Actinoplanes II D A1γ’ - 3b 9(H4,6), 10(H4,6) PII 7273 Cattelatospora II D - 9(H4,6), 10(H8,6) PII 7173 Catenuloplanes VI D A3α - 10(H4), 11(H4) PIII 7173 Couchioplanes VI D A3α - 9(H4) PII 6972 Dactylosporangium II D A1γ - 3b 9(H4,6,8) PII 6973 Pilimelia II D A1γ - 2d 9(H4,2) PII 71 Spirilliplanes II - 2d 10(H4) PII 69 Verrucosispora II - A1γ’ 2b 9(H4) PII 70 Họ Propionibacteriaceae và Nocardia 5763 Propionibacterium I A3γ’ - 9(H4) Friedmaniella I A3γ’ - 9(H4) PI 73 Luteococcus I A3γ’ - 1a 9(H4) PI 6668 Microlunatus I A3γ’ - 2d 9(H4) PII 68 Propioniferax I A3γ’ - 9(H4), 7(H4) PI 5963 Tessaracoccus I A3γ’ - 8(H4) PI 74 Nocardioides I A3γ - 3a 9(H4) PI 6772 Aeromicrobium I A3γ - 3a 9(H4) PII 6972 Hongia I A3γ - 2d 9(H4) PI 71 Kribbella I A3γ - 9(H4) PIII 6870 Marmoricola I A3γ - 8(H4) PI 72 8(H4) PIII/ PII 6879 7(H2), 9(H2) PIV 71 9(H4), 10(H4) PIII 6468 9(H2,4,6) PII 6669 1a Họ Pseudonocardiaceae Pseudonocardia III A A1γ - Actinobispora IV A A1γ - Actinopolyspora IV A A1γ - Amycolatopsis III A A1γ - Kibdelosporangium III A - 3c 9(H4) PII 66 Prauserella IV A - 3f 9(H2,4) PII 6769 Saccharomonospora III A A1γ - 2a 9(H4) PII 6974 Saccharopolyspora IV A A1γ - 2c 9(H4) PIII 7077 Thermocrispum III C 9(H4) PII 6973 - 1 2c Họ Actinosynnemataceae Actinosynnema III C A1γ - 9(H4,6) PII 6971 Actinokineospora III C A1γ - 9(H4) PII 73 Kutzneria III C - 9(H4) PII 70- 71 Saccharothrix C III - A1γ PII 7076 9(H0,2,4) PIV 6971 9(H4), 10(H4) Họ Streptosporangiaceae Streptosporangium III B A1γ - Acrocarpospora III B A1γ - 9(H2,4) PIV/ PII 6869 Herbidospora III B - 10(H4,6) PIV 71 Microbispora III B A1γ - 3c 9(H0,2,4) PIV 6774 Microtetraspora III B A1γ - 3c 9(H0,2,4) PIV 66 Nonomuraea III B A1γ - 3c 9(H0,2,4) PIV 6469 Planobispora III B A1γ - 3c 9(H0,2,4) PIV 7071 Planomonospora III B A1γ - 3c 9(H0,2,4) PIV 72 Planotetrespora III B - 3c 3c PIV Họ Nocardiopsaceae Nocardiopsis III C Thermobifida III C A1γ - 3d 10(H2,4,6) PIII - 3c 10(H6,8) PII 6469 Họ Thermomonosporaceae Thermomonospora III B A1γ - 3e 9(H6,8) PI - 3e 9(H4,6) PII 73 Actinocollaria III Actinomadura III B A1γ - 3a 9(H6,8) PI 6670 Spirillospora III B A1γ - 3e 9(H4,6) PI 6971 10(H4), 11(H4) PI 7173 Họ Glycomycetaceae Glycomyces - II 2c Họ Streptomycetaceae Streptomyces I A3γ - Kitasatospora I/III A3γ - 2c 9(H6,8) PII 6978 9(H6,8) PII 6673 Họ Frankiaceae và một số họ liên quan III - 1 9(H4,6,8) PI 6671 Geodermatophilus III - 2b 9(H4) PII 7376 Frankia Microsphaera III A1γ Cryptosporangium II Sporichthya I A3γ - 8(H4) - 9(H6,8) PII 70 - 9(H6,8) PI 70 9(H4) PIII 6479 PIV 71 68 Các họ khác Kineosporia I/III A3γ Thermobispora III - 9(H0,2) Thermoactinomyces III - 7,9 5355 Các số liệu trên được lấy từ sách Bergey’s manual systematic of bacteriology và sách Identification manual of actinomycetes. Thành tế bào: Theo Lechevalier và Lechevalier, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 8 loại dựa trên các đặc điểm về thành phần acid amin, đặc biệt là acid diaminopimelic, lysine và thành phần đường trong thành tế bào, cụ thể là Loại thành Acid tế bào diamino Các acid amin khác I LL-A2pm Gly* II mesoA2pm Gly** III mesoA2pm IV mesoA2pm V Lys, Orn VI Lys VII Lys, A2bu Asp VIII Đường Ara, Gal*** Asp Asp Tất cả các loại thành tế bào đều chứa alanine, acid glutamic, glucosamine và acid muramic. A2pm: Acid diamino pimelic có thể gồm các đồng phân quang học LL- A 2pm, DL- A2pm (meso- A2pm), DD- A2pm. Ngoài ra còn có OH- A2pm khi có thêm nhóm OH gắn vào vị trí C thứ 4. Lys: Lysine Orn: Ornitin A2bu: acid diamino butyric Gly: glycin *Glycin nằm trong mối liên kết giữa hai mạch tetrapeptid ** Glycin thay thế L- alanin ở vị trí đầu tiên trong mạch tetrapeptid Asp: Asparagin Ara: Arabinose Gal: Galactose *** Trong xạ khuẩn chứa acid mycolic như Nocardia và Mycobacterium, thành tế bào chứa arabinogalactan, là hợp chất được tổng hợp từ arabinose và galactose. Thành phần đường: Thành phần đường Các loại đường chủ yếu A Arabinose, Galactose (không chứa Xylose) B Madurose (không chứa Arabinose hay Xylose) C Không có đường đặc trưng D Arabinose, Xylose Peptidoglycan: Theo Schleifer và Kandler (1972), peptidoglycan ở xạ khuẩn được chia thành các nhóm như sau: Vị trí của Ký Ký Cầu nối giữa hai mạch mối liên hiệu hiệu tetrapeptid kết Ký Acid amin ở hiệu vị trí thứ 3 A α L-Lys β L-Orn γ mesoA2pm 3-4 1 2 Tiểu đơn vị peptid α L-Lys 3 L-acid amin chứa một nhóm carboxyl (gly) hoặc chuỗi peptid α ngắn của acid amin đó L-Lys β L-Orn γ mesoA2pm α L-Lys β L-Orn γ mesoA2pm δ L-A2bu α L-Lys β L-Hsr γ L-Glu δ L-Ala D-acid amin (D-Orn hay D-A2bu) α L-Orn β L-Hsr γ L-A2bu 4 B 2-4 Trực tiếp 1 2 D-acid amin chứa hai nhóm carboxyl (D-Asp hay D-Glu) L-acid amin (Glyn-L-Lys) Dấu phẩy (‘): alanine ở vị trí thứ nhất trong mạch tetrapeptid đã được thay thế bởi glycine. Ví dụ: Loại peptidoglycan của chi Actinoplanes là A1γ’ có nghĩa là: Hai mạch tetrapeptid liên kết với nhau ở vị trí acid amin số 3 và 4, mối liên kết này là trực tiếp và acid amin ở vị trí số 3 là meso- A2pm. Thành phần acid béo: Ký hiệu 1 10- 10- 17 18 - - Không IsoIso- AnteisoBão Cyclopropan bão Methyl- Methyl- e hòa 14/16/18 15/17 15/17 hòa a +++ +++ - - - - 2 3 b +++ +++ - - - - ++ - c +++ +++ - - - - - ++ a ++ + +++ + (+) - - - b (+) + ++ +++ + - - - c+ (v) +++ + +++ - - - d+ + +++ +++ +++ - - - a +++ ++ +++ (+) (+) (+) +++ - b+ + +++ +++ ++ ++ (+) - c+ + ++ + + +++ (+) - d+ + +++ ++ +++ (+) +++ - (v): ít hơn 5% Thành phần menaquinone: Xạ khuẩn chỉ chứa menaquinone, không chứa ubiquinone. Ký hiệu 8(H 2) hay MK-8(H2) chỉ menaquinone chứa một trong số tám đơn vị isoprene bị hydro hóa. Thành phần phospholipid: Ký Thành phần phospholipid đặc trưng hiệu PI Phosphatidylglycerol(v) PII Phosphatidylethanolamine PIII Phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine(v), phosphatidylmethyl-ethanolamine(v), phosphatidylglycerol(v), không chứa phospholipid chứa glucosamine Phospholipid chứa glucosamine, PIV phosphatidylethanolamine(v), phosphatidylmethylethanolamine(v) PV Phospholipid chứa glucosamine, phosphatidylglycerol Tất cả các loại đều chứa phosphatidylinositol Vị trí phân loại của Xạ khuẩn: Lớp Actinobacteria Dưới lớp Actinobacteridae Bộ Actinomycetales Dưới bộ Actinomycineae Họ Actinomycetaceae Các chi: Actinomyces, Arcanobacterium, Mobiluncus Actinobaculum, Dưới bộ Micrococcineae Họ Micrococcaceae Các chi: Micrococcus, Arthrobacter, Nesterenkonia, Renibacterium, Rothia Kocuria, Họ Bogoriellaceae Chi: Bogoriella Họ Brevibacteriaceae Chi: Brevibacterium Họ Cellulomonadaceae Chi: Cellulomonas Họ Dermabacteraceae Các chi: Dermabacter, Brachybacterium Họ Dermacoccaceae Các chi: Dermacoccus, Demetria, Kytococcus Họ Dermatophilaceae Chi: Dermatophilus Họ Intrasporangiaceae Các chi: Intrasporangium, Terracoccus, Tetraphaera Janibacter, Terrabacter, Họ Jonesiaceae Chi: Jonesia Họ Microbacteriaceae Các chi: Microbacterium, Agrococcus, Agromyces, Clavibacter, Cryobacterium, Curtobacterium, Frigoribacterium, Leifsonia, Leucobacter, Rathayibacter Họ Promicromonosporaceae Chi: Promicromonospora Họ Rarobacteraceae Chi: Rarobacter Họ Sanguibacteraceae Chi: Sanguibacter Incertae sedis (chưa xác định) Các chi : Beutenbergia, Ornithinicoccus, Kineococcus Dưới bộ Corynebacterineae Họ Corynebacteriaceae Các chi: Corynebacterium, Turicella Họ Dietziaceae Chi: Dietzia Họ Gordoniaceae Chi: Gordonia Họ Mycobacteriaceae Chi: Mycobacterium Họ Nocardiaceae Các chi: Nocardia, Rhodococcus Họ Tsukamurellaceae Chi: Tsukamurella Incertae sedis (chưa xác định) Các chi : Skermania, Williamsia Dưới bộ Micromonosporineae Họ Micromonosporaceae Các chi: Micromonospora, Actinoplanes, Catellatospora, Catenuloplanes, Couchioplanes, Dactylosporangium, Pilimelia, Spirilliplanes, Verrucosispora Dưới bộ Propionibacterineae Họ Propionibacteriaceae Các chi: Luteococcus, Tessaracoccus Propionibacterium, Microlunatus, Friedmaniella, Propioniferax, Họ Nocardioidaceae Các chi: Nocardioides, Kribbella, Marmoricola Aeromicrobium, Hongia, Dưới bộ Pseudonocardineae Họ Pseudonocardiaceae Các chi: Pseudonocardia, Actinobispora, Actinopolyspora, Amycolatopsis, Kibdelosporangium, Prauserella, Saccharomonospora, Saccharopolyspora, Thermocrispum Họ Actinosynnemataceae Các chi: Actinosynnema, Actinokineospora, Saccharothrix Incertae sedis (chưa xác định) Các chi: Kutzneria, Streptoalloteichus Dưới bộ Streptosporangineae Họ Streptosporangiaceae Các chi: Streptosporangium, Acrocarpospora, Herbidospora, Microbispora, Microtetraspora, Nonomuraea, Planomonospora, Planotetraspora Họ Nocardiopsaceae Các chi: Nocardiopsis, Thermobifida Họ Thermomonosporaceae Các chi: Thermomonospora, Actinomadura, Spirillospora Actinocorallia, Dưới bộ Glycomycineae Họ Glycomycetaceae Chi: Glycomyces Dưới bộ Streptomycineae Họ Streptomycetaceae Các chi: Streptomyces, Kitasatospora Dưới bộ Frankineae Họ Frankiaceae Chi: Frankia Họ Acidothermaceae Chi: Acidothermus Họ Geodermatophilaceae Các chi: Geodermatophilus, Blastococcus Họ Microsphaeraceae Chi: Microsphaera Họ Sporichthyaceae Chi: Sporichthya Incertae sedis (chưa xác định) Chi: Cryptosporangium Bộ Bifidobacteriales Họ Bifidobacteriaceae Các chi: Bifidobacterium, Gardnerella Dưới lớp Acidimicrobidae Bộ Acidimicrobiales Họ Acidimicrobiaceae Chi: Acidimicrobium Dưới lớp Coriobacteridae Bộ Coriobacteriales Họ Coriabacteriaceae Các chi: Coriobacter, Atopobium, Cryptobacterium, Denitrobacterium, Slackia Collinsella, Eggerthella, Dưới lớp Rubrobacteridae Bộ Rubrobacteriales Họ Rubrobacteriaceae Chi: Rubrobacter Dưới lớp Sphaerobacteridae Bộ Sphaerobacteriales Họ Sphaerobacteriaceae Chi: Sphaerobacter Mô tả một số chi thường gặp: Chi Rhodococcus: Phát triển dưới dạng que hoặc khuẩn ty cơ chất phân nhánh. Ở tất cả các chủng, chu trình sống (morphogenetic) đều bắt nguồn từ giai đoạn hình cầu hoặc que ngắn. Bằng cách phân đoạn, các tế bào hình cầu sẽ tạo thành dạng que rồi dạng sợi, sợi phân nhánh và hệ sợi. Một số chủng còn tạo khuẩn ty khí sinh phân nhánh hoặc bó sợi (synnemata). Chúng không có khả năng chuyển động cũng như không hình thành bào tử hay nội bào tử. Gram dương. Acid-alcohol fast (nhuộm kháng acid-cồn) ở một số giai đoạn phát triển. Hiếu khí. Hóa dị dưỡng hữu cơ. Catalase dương tính. Hầu hết các chủng đều mọc tốt trên các môi trường tiêu chuẩn ở 30oC, số khác cần thiamin cho sinh trưởng. Khuẩn lạc có thể sần sùi hoặc trơn nhẵn, có màu vàng sẫm, kem, vàng, vàng da cam, đỏ hoặc không màu. Arylsulfatase âm tính, nhạy cảm với lysozyme, không phân hủy được casein, cellulose, chitin, elastin hay xylan. Có thể sử dụng được rất nhiều loại hợp chất hữu cơ làm nguồn cacbon và nguồn năng lượng. Thành tế bào chứa lượng lớn acid meso- diaminopimelic (meso-DAP), arabinose và galactose. Chứa diphosphatidylglycerol, phosphatidylethanolamin, phosphatidylinositol mannoside. Thành phần menaquinone chính là MK-8(H2) và MK-9(H2). Chứa lượng lớn acid tuberculostearic mạch thẳng, không bão hòa và acid mycolic với 32-66 cacbon, với nhiều nhất bốn liên kết đôi. Tỷ lệ mol G+C trong ADN là 63-72%. Có nhiều trong đất và phân gia súc. Một số chủng gây bệnh cho người và động vật. Loài chuẩn: Rhodococcus rhodochrous Chi Nocardioides: Sợi sơ cấp phân nhánh trên bề mặt, sau đó xâm nhập vàp trong thạch rồi đứt đoạn thành dạng que hay cầu hay không đều. Sợi khí sinh có thể thưa thớt, phân nhánh hoặc không sau đó cũng đứt thành những mẩu ngắn hoặc dạng que. Những mẩu này sẽ là nguồn gốc của những sợi mới. Không có tế bào di động. Khuẩn lạc nhão. Gram dương. Không nhuộm kháng acid ( Non-acid fast ). Catalase dương tính. Hiếu khí bắt buộc. Hóa dị dưỡng hữu cơ. Mọc dễ dàng trên các môi trường tiêu chuẩn. Nhạy cảm với thực khuẩn thể đặc hiệu. Acid amin chính trong thành tế bào là L-DAP và glycine. Không chứa acid mycolic. Phospholipid chủ yếu là phosphatidylglycerol và acylphosphatidlyglycerol. Acid béo chiếm ưu thế là 14-methylpentadecanoic. Thành phần menaquinone chính là MK-8(H4). Tỷ lệ mol G+C trong ADN từ 66,1-72,7%. Có nhiều trong đất. Loài chuẩn: Nocardioides albus Chi Pseudonocardia: Sợi khí sinh và sợi cơ chất đều sinh bào tử dạng chuỗi. Sợi phân đoạn, thường có dạng zich-zac với xu hướng phồng lên ở ngọn hoặc ở giữa. Sợi kéo dài bằng cách nảy chồi. Các đoạn sợi có chức năng của bào tử hoặc biến đổi thành bào tử. Thành sợi có hai lớp. Gram dương. Không có giai đoạn di động. Hiếu khí. Sinh trưởng trên nhiều loại môi trường hữu cơ hoặc tổng hợp. Ưa ấm hoặc ưa nhiệt. Loài chuẩn: Pseudonocardia thermophila Chi Saccharopolyspora: Sợi cơ chất phát triển mạnh, phân nhánh, đứt thành các đoạn dạng que với kích thước 1x5μm, chủ yếu ở những phần già hơn của khuẩn lạc. Khuẩn ty khí sinh phân đoạn tạo các chuỗi bào tử. Gram dương. Không nhuộm kháng acid. Hiếu khí. Khuẩn lạc mỏng, nhô lên, hơi nhăn, sợi khí sinh ít, thường tạo thành chùm, chủ yếu ở những phần già. Có thể sử dụng nhiều loại chất hữu cơ như nguồn cacbon và năng lượng duy nhất, có thể phân giải adenine, kháng nhiều loại chất kháng sinh nhưng nhạy cảm với lysozym. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 77%. Loài chuẩn: Saccharopolyspora hirsute Chi Intrasporangium: Sợi phân nhánh, có xu hướng đứt thành nhiều đoạn có kích thước và hình dáng khác nhau. Không bao giờ có sợi khí sinh. Các túi bào tử hình oval hay hình quả chanh được tạo thành ở giữa hoặc/và ở đầu sợi. Các bào tử không di động. Gram dương. Không nhuộm kháng acid. Hóa dị dưỡng hữu cơ. Catalase dương tính. Hiếu khí. Mọc tốt nhất ở 28-37oC, không mọc được ở 45oC. Sinh trưởng tốt hơn trên các môi trường chứa peptone và cao thịt. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 68,2%. Thành tế bào chứa L-DAP và glycine. Thành phần phospholipid chủ yếu là một loại phospholipid chứa glucosamin chưa biết. Thành phần acid béo chủ yếu là các acid béo mạch thẳng bão hòa và không bão hòa. Menaquinone chính là MK-8. Loài chuẩn: Intrasporangium calvum Chi Actinopolyspora: Hệ sợi phân nhánh, hình thành rất nhiều sợi khí sinh có đường kính khoảng 1 μm. Sợi cơ chất hầu hết không đứt đoạn. Cuống sinh bào tử chứa 20 hoặc hơn bào tử dạng que ngắn hoặc dạng cầu với vỏ nhẵn hình thành trên sợi khí sinh theo chiều hướng gốc. Sợi cơ chất không sinh bào tử. Gram dương. Nhuộm kháng acid. Thành tế bào chứa meso-DAP, arabinose và galactose. Không chứa acid mycolic. Hiếu khí. Hóa dị dưỡng hữu cơ. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 64,2%. Loài chuẩn: Actinopolyspora halophila Chi Saccharomonospora: Chủ yếu sinh bào tử đơn trên sợi khí sinh. Bào tử không bền nhiệt, không có khả năng di động, được hình thành trên các cuống sinh bào tử đơn giản, không phân nhánh, dài ngắn khác nhau. Trên môi trường thạch, hệ sợi dinh dưỡng phân nhánh, bao phủ bởi lớp sợi khí sinh với các bào tử mọc dày đặc dọc trên các sợi. Sợi khí sinh ban đầu có màu trắng rồi chuyển thành xám xanh và xanh sẫm. Sắc tố xanh cũng có ở sợi dinh dưỡng và khuếch tán ra môi trường. Thành tế bào chứa mesoDAP, arabinose và galactose. Không chứa acid mycolic. Chứa lượng lớn iso- và anteiso- acid béo, phosphatidylethanolamin và MK-9(H4). Hiếu khí. Hóa dị dưỡng hữu cơ. Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng là 35-50oC, pH 7-10. Sinh catalase, deaminase và phosphatase. Phân hủy được casein, gelatin, tinh bột. xylan và tyrosin. Đặc biệt có thể sử dụng glycerol làm nguồn cacbon. Phân lập được trong đất, chất lắng cặn ở hồ, than bùn, thấy nhiều trong phân bón, phân compôt, và cỏ khô. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 69-74%. Loài chuẩn: Saccharomonospora viridis Chi Frankia: Không sinh sợi khí sinh. Túi bào tử thường sinh trên cuống sinh bào tử. Bào tử không có khả năng di động với hình dạng không cố định, từ không màu đến màu đen. Trong điều kiện khó khăn như không có quá trình cố định đạm, các túi (vesicle) có thể được hình thành. Gram dương- hoặc Gram không cố định (variable). Hiếu khí hoặc vi hiếu khí. Catalase dương tính. Ưa ấm. Hóa dị dưỡng hữu cơ. Thường mọc rất chậm (thời gian giữa hai lần phân đôi tế bào là 1-7 ngày). Hầu hết các chủng đều có khả năng cố định nitơ không khí invitro và in planta. Thành tế bào chứa meso-DAP, acid glutamic, alanin, acid muramic, và glucosamine. Thành phần phospholipid gồm phosphatidylinositiol mannoside, phosphatidylinositol và diphosphatidylglycerol. Acid béo dạng thường, mạch thẳng, và không bão hòa. Thành phần đường gồm xylose, madurose hoặc fucose, hoặc chỉ gồm glucose hoặc galactose. Nhiều chủng gồm 2-O-methyl-D-mannose, hầu hết các chủng chứa rhamnose. Hầu hết cộng sinh với một số thực vật hạt kín nhất định, tạo các nốt sần trên rễ ở vật chủ thích hợp. Có thể tìm trong đất. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 66-71%. Loài chuẩn: Frankia alni Chi Actinoplanes: Phát triển dưới dạng sợi phân nhánh, không đứt đoạn. Gram dương, nhưng một phần sợi dinh dưỡng có thể là Gram âm. Không nhuộm kháng acid. Rất ít sợi khí sinh hoặc không có. Tạo nhiều loại sắc tố có khả năng khuếch tán. Bào tử chứa trong túi bào tử, sinh trên cuống sinh bào tử hoặc không cuống, ít khi trong thạch. Dưới điều kiện nhất định, nhiều chủng có hệ sợi sắp xếp dạng que (palisade). Khi đó, túi bào tử chủ yếu được sinh ở đầu các sợi. Bào tử hình cầu hoặc que ngắn, sắp xếp theo nhiều cách khác nhau bên trong túi bào tử, được hình thành bằng cách đứt đoạn sợi bên trong túi bào tử trực tiếp hoặc sau vài lần phân nhánh. Sau khi ngâm trong nước, bào tử di động được giải phóng ra từ túi bào tử, trong một số trường hợp, khả năng di động xuất hiện sau khi bào tử được giải phóng. Bào tử di động chứa tiên mao cực. Thành tế bào chứa meso-DAP và glycin. Thành phần đường chứa D-xylose và L-arabinose. Thành phần phospholipid chính là phosphatidylethanolamin. Hiếu khí, hóa dị dưỡng hữu cơ, ưa ấm hoặc ưa nhiệt vừa phải. Hầu hết các chủng đều không cần các nhân tố sinh trưởng hữu cơ. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 72-73%. Loài chuẩn: Actinoplanes philippinensis Chi Pilimelia: Túi bào tử được sinh ra trên bề mặt của cơ chất từ cuống sinh bào tử. Túi bào tử có hình cầu, hình trứng, hình quả lê, hình chuông hay hình trụ, có kích thước xấp xỉ 10-15 μm. Túi bào tử chứa rất nhiều bào tử xếp thành chuỗi song song hoặc các hàng cuộn không đều. Gram dương. Khuẩn ty cơ chất có đường kính 0,2-0,8 μm, phân nhánh và có vách ngăn. Khuẩn ty khí sinh thật sự không được hình thành. Thành tế bào chứa meso-DAP và glycin. Thành phần đường chứa xylose và arabinose. Chỉ mọc được trên môi trường hỗn hợp. Khuẩn lạc nhỏ, đặc hoặc mềm. Khuẩn ty cơ chất có màu vàng chanh, vàng, da cam hoặc xanh xám, chuyển sang nâu đến nâu sẫm khi già. Hiếu khí, hóa tự dưỡng hữu cơ, điều kiện sinh trưởng tối ưu là ở pH 6,5-7,5 và 20-30 oC. Có khả năng phân hủy có chất cheratin (lông tóc của động vật có vú). Tỷ lệ mol GC trong ADN là 72-73%. Loài chuẩn: Pilimelia terevasa Chi Dactylosporangium: Túi bào tử hình ngón tay hoặc hình chùy được hình thành từ cuống sinh bào tử ngắn của khuẩn ty cơ chất. Các túi bào tử phát triển đơn lẻ hoặc tụ thành từng đám trên bề mặt cơ chất. Mỗi túi bào tử chứa một dãy gồm ba đến bốn bào tử. Bào tử có hình chữ nhật, hình elip, hình trứng hoặc hơi trụ, có khả năng di động nhờ một túm tiên mao cực. Không có khuẩn ty khí sinh thực sự. Khuẩn ty cơ chất có đường kính 0,5-1,0 μm, phân nhánh và ít khi có vách ngăn. Gram dương , Không nhuộm kháng acid. Thành tế bào chứa meso-DAP và glycin. Thành phần đường chứa xylose và arabinose. Có khả năng sinh trưởng trên nhiều loại môi trường. Khuẩn lạc đặc, hơi thô, thường phẳng, đôi khi nhô lên một bề mặt trơn hoặc hơi nhăn. Khuẩn ty cơ chất có màu vàng xanh, da cam, đỏ hay nâu. Hiếu khí, hóa tự dưỡng hữu cơ, điều kiện sinh trưởng tối ưu là ở pH 6,0-7,0 và 25-37 oC. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 71-73%. Loài chuẩn: Dactylosporangium aurantiacum Chi Micromonospora: Có hệ sợi sinh trưởng mạnh, phân nhánh, có vách ngăn, đường kính trung bình 0,5 μm. Bào tử không có khả năng di động mọc trực tiếp hoặc từ cuống sinh bào tử. Không có khuẩn ty khí sinh. Gram dương, không nhuộm kháng acid. Thành tế bào bào chứa meso-DAP, và/ hoặc acid 3hydroxy diaminopimelic, glycin. Thành phần đường chứa xylose và arabinose. Thành phần phospholipid gồm phosphatidylethanolamin, phosphatidylinositol và phosphatidylinositol mannoside. Thành phần menaquinone chính là MK-9(H4), MK-10(H4), MK-10(H6) và MK-12(H6). Hiếu khí đến vi hiếu khí. Hóa dị dưỡng hữu cơ. Nhạy cảm với pH dưới 6,0. Có khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ từ 20-40oC. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 71-73%. Loài chuẩn: Micromonospora chalcea Chi Streptomyces: Hệ sợi sinh dưỡng phân nhánh nhiều lần, ít khi đứt đoạn, đường kính 0,5-2,0 μm. Khuẩn ty khí sinh ở giai đoạn trưởng thành tạo chuỗi từ ba đến nhiều bào tử. Một số ít loài hình thành chuỗi bào tử ngắn trên khuẩn ty cơ chất. Bào tử không có khả năng di động. Các khuẩn lạc ban đầu thường trơn nhẵn nhưng sau đó khuẩn ty khí sinh sẽ phát triển rất mạnh mẽ. Sinh nhiều loại sắc tố khác nhau cũng như sắc tố có khả năng khuếch tán ra môi trường. Rất nhiều chủng sản sinh ra một hoặc nhiều loại chất kháng sinh. Hiếu khí, Gram dương, không nhuộm kháng acid-cồn, hóa dị dưỡng hữu cơ, catalase dương tính. Thường có khả năng khử nitrate thành nitrit, phân hủy adenine, esculin, casein, gelatin, hypoxanthine, tinh bột và L-tyrosine. Có khả năng sử dụng nhiều hợp chất hữu cơ làm nguồn cacbon duy nhất. Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 25-35 oC, pH tối ưu là 6,5-8,0. Thành tế bào chứa L-DAP, không chứa acid mycolic. Thành phần acid béo gồm phần lớn acid béo bão hòa, isovà anteiso-. Thành phần menaquinone chính là MK-9(H6), MK-9(H8). Thành phần phospholipid chính là diphosphatidylglycerol, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol và phosphatidylinositol mannoside. Có nhiều trong đất, phân compôt. Một số loài gây bệnh cho người và động vật, một số loài gây bệnh ở thực vật. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 69-78%. Loài chuẩn: Streptomyces albus Chi Actinomadura: Hệ sợi sinh dưỡng phân nhánh, rất phát triển. Khuẩn ty cơ chất không đứt đoạn, có hoặc không có khuẩn ty khí sinh. Khuẩn ty khí sinh ở giai đoạn trưởng thành sẽ hình thành chuỗi ngắn, đôi khi dài của các bào tử đốt (arthrospore). Chuỗi bào tử có thể ở dạng thẳng, uốn cong hoặc xoắn không đều (1-4 vòng). Bề mặt bào tử nhẵn hoặc có các nốt. Khuẩn ty khí sinh khi đã hình thành bào tử có màu trắng, xám hay nâu, vàng, đỏ, xanh lục, xanh lam hay tím. Hiếu khí, hóa dị dưỡng hữu cơ. Nhiệt độ sinh trưởng từ 20 đến 45oC. Một số loài ưa nhiệt. Gram dương. Thành tế bào chứa meso-DAP, không chứa acid mycolic. Tế bào chứa madurose. Thành phần menaquinone chính là MK-9(H 4) và MK-9(H6). Tỷ lệ mol GC trong ADN là 65-69%. Loài chuẩn: Actinomadura madurae Chi Microbispora: Khuẩn ty khí sinh phân nhánh, hình thành từng cặp hai bao tử gắn với nhau. Bào tử mọc trực tiếp hoặc trên cuống sinh bào tử ngắn, hình cầu hoặc oval, đường kính trung bình 1,2-1,6μm và không có khả năng di động. Thành tế bào chứa acid muramic, meso-DAP nhưng không chứa đường đặc trưng. Thành phần đường của toàn tế bào chứa madurose. Thành phần menaquinone chính là MK9(H4). Thành phần phospholipid chính chứa phosphatidylcholine và phospholipid chứa glucosamine. Gram dương, hiếu khí, hóa dị dưỡng hữu cơ. Ưa ấm và ưa nhiệt. Hầu hết các loài để sinh trưởng đều cần các vitamin nhóm B, đặc biệt là thiamin. Trong tự nhiên thường tồn tại trong dầu. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 71-73%. Loài chuẩn: Microbispora rosea Chi Streptosporangium: Túi bào tử hình cầu đường kính khoảng 10μm được hình thành trên khuẩn ty khí sinh. Các bào tử được hình thành bằng cách hình thành vách ngăn của sợi cuộn xoắn không phân nhánh bên trong túi bào tử. Bào tử hình cầu, hình oval hoặc hình que, không có khả năng di động. Thành tế bào chứa acid muramic, meso-DAP nhưng không chứa đường đặc trưng. Thành phần đường của toàn tế bào chứa madurose. Thành phần phospholipid chính chứa phosphatidylcholine và phospholipid chứa glucosamine. Gram dương, hiếu khí, hóa dị dưỡng hữu cơ. Ưa ấm, một số loài có khả năng chịu được nhiệt độ cao. Một số loài cần các vitamin nhóm B cho sinh trưởng. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 69-71%. Loài chuẩn: Streptosporangium roseum Chi Thermomonospora: Khuẩn ty khí sinh sản sinh ra các bào tử đơn lẻ, bền nhiệt, không có khả năng di động. Bào tử có thể sinh trực tiếp nhưng thường là trên đầu của các cuống sinh bào tử có hoặc không phân nhánh. Bào tử cũng có hể được sinh ra từ khuẩn ty cơ chất. Gram dương. Thành tế bào chứa meso-DAP nhưng không chứa các loại acid amin hay đường đặc trưng. Hiếu khí, hóa dị dưỡng hữu cơ. Cần cung cấp nguồn acid amin và các vitamin cho sinh trưởng như cao nấm men. Tất cả các chủng đều có thể sinh trưởng được ở nhiệt độ 40-48 oC, pH 7,0-9,0. pH > 8,0 thích hợp cho sự sản sinh khuẩn ty khí sinh và hình thành bào tử. Sản sinh catalase, deaminase, β-glucosidase và β-galactosidase. Có khả năng phân giải esculin, xylan, casein, gelatin và cacboxymetylcellulose. Bào tử chết ở 90 oC trong 30 phút trong nước. Tất cả các chủng đều nhạy cảm với novobiocin (50 μg/ml). Có thể phân lập được từ đất nhưng tồn tại nhiều trong phân bón, phân compôt và cỏ khô đã sấy. Loài chuẩn: Thermomonospora curvata Chi Actinosynnema: Khuẩn ty gồm hai loại là khuẩn ty cơ chất hình thành bó sợi (synnemata) trên bề mặt thạch và khuẩn ty khí sinh hình thành từ bó sợi. Khuẩn ty sinh ra các chuỗi bào tử. Các bào tử có khả năng hình thành tiên mao trong môi trường nước. Thành tế bào chứa meso-DAP, acid glutamic, alanin, glucosamin và acid muramic. Tế bào không chứa thành phần đường đặc trưng. Thành phần phospholipid chính là phosphatidylinositol mannoside, phosphatidylinositol, phosphatidylethanolamine và phosphatidylglycerol. Acid béo gồm loại mạch thẳng và mạch nhánh. Thành phần menaquinon chính là MK-9(H4) và MK-9(H6). Gram dương, không acid fast, sinh catalase. Hiếu khí. Ưa ấm. Hóa dị dưỡng hữu cơ. Hầu hết các chủng được phân lập trực tiếp từ mô thực vật như lá cỏ bên bờ sông. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 73%. Loài chuẩn: Actinosynnema mirum Chi Nocardiopsis: Khuẩn ty cơ chất phát triển mạnh, phân nhánh nhiều, có thể đứt đoạn thành các thể hình cầu và hình que. Khuẩn ty khí sinh dài, phân nhánh không đều, thẳng, uốn hoặc hình zích zắc, đứt đoạn thành các bào tử với chiều dài khác nhau. Bào tử hình oval hoặc kéo dài, bề mặt nhẵn. Gram dương, hiếu khí, hóa dị dưỡng hữu cơ, không nhuộm kháng axít. Thành tế bào chứa meso-DAP, không chứa đường đặc trưng, không có acid mycolic. Thành phần menaquinon chính là MK-10(H2,4,6) hoặc MK9(H4,6). Tỷ lệ mol GC trong ADN là 64-69%. Loài chuẩn: Nocardiopsis dassonvillei Dưới đây là hình ảnh một số chi xạ khuẩn thường gặp: Frankia cộng sinh ở rễ cây Phi lao Nang bào Nocardia- Khuẩn lạc và khuẩn ty đứt đoạn Một số loài Streptomyces Một số chi xạ khuẩn: A-Microtetraspora; B- Planomonospora; C- Actinosynnema; DActinobispora; E- Saccharothrix; F- Crosiella Chi Actinomadura Các chi: A- Micromonospora; B- Dactylosporangium; C- Verrucosispora D- Pilimelia; E- Catenuplanes Chi Actinoplanes Loài Actinomyces viscosus Trên đây là quan hệ phát sinh chủng loại của khoảng 90 chi xạ khuẩn khác nhau Một số phương pháp phân lập xạ khuẩn: Môi trường HV (Humic acid-vitamin agar) Thành phần: Acid humic 1g CaCO3 0,02 g FeSO4.7H2O 0,01 g KCl 1,71 g MgSO4.7H2O 0,05 g Na2HPO4 0,5 g Hỗn hợp vitamin nhóm B* 5 ml Cycloheximide 500 mg Thạch 18 g Nước cất 1L pH 7,2 *Hỗn hợp vitamin nhóm B Thiamine-HCl 10 mg Riboflavin 10 mg Niacin 10 mg Pyridoxin-HCl 10 mg Inositol 10 mg Ca-Pantothenate 10 mg Acid p-Aminobenzoic 10 mg Biotin 10 mg Nước cất 10 ml Môi trường YS (Yeast extract-Soluble starch agar) Cao nấm men 2g Tinh bột tan 10 g Thạch 18 g Nước cất 1L pH 7,3 Thường sử dụng môi trường YS pha loãng 5 lần để phân lập xạ khuẩn và pha loãng 2 lần để nghiên cứu. Môi trường Maltose-Bennette Cao nấm men 1g Cao thịt 1g NZ amine 2g Maltose monohydrat 10 g Thạch 18 g Nước cất 1L pH 7,3 Môi trường ISP-2 Cao nấm men 4g Cao malt 10 g Glucose 4g Thạch 18 g Nước cất 1L pH 7,2 Môi trường dịch thể YG (Yeast extract-Glucose) Yeast extract 1% Glucose 1% Phương pháp RC (Rehydration- Centrifugation method): dùng để phân lập xạ khuẩn có khả năng di động - Để mẫu khô tự nhiên trong 3-5 ngày, nghiền nhỏ mẫu - Lấy 0,5 g mẫu cho vào 50 ml đệm phosphat 10 mM- 5% cao nấm men (pH 7) - Loại bỏ phần nổi trên bề mặt - Giữ ở 28oC trong 1,5 giờ - Chuyển 8 ml lớp dịch phía trên sang ống ly tâm - Ly tâm với tốc độ 3000 rpm (1500 x g) trong 20 phút - Giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút - Chuyển 3 ml lớp dịch trên sang ống khác. - Lấy 1 ml pha loãng với nước cất (10-3, 10-4) - Trải trên môi trường HV với độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4 - Nuôi cấy ở nhiệt độ 28oC trong 14-21 ngày Phương pháp SDS-YE (Sodium dodecyl sulfate – Yeast extract method): dùng để phân lập tất cả các loại xạ khuẩn - Để mẫu khô tự nhiên trong 3-5 ngày, nghiền nhỏ mẫu - Lấy 1 g mẫu cho vào 10 ml nước cất vô trùng (10-1) - Lấy 1 ml dịch trên cho vào 9 ml SDS-YE trong đệm phosphat (10 -2) (SDS 0,05%, cao nấm men 6%, đệm phosphat 5mM, pH 7,0) - Sốc nhiệt ở 40oC trong 20 phút - Pha loãng bằng nước cất vô trùng - Trải trên môi trường HV - Nuôi cấy ở 28oC trong 14-21 ngày Phương pháp DH (Dry heating method): dùng để phân lập xạ khuẩn chủ yếu thuộc chi Streptomyces - Để mẫu khô tự nhiên trong 3-5 ngày, nghiền nhỏ mẫu - Sấy mẫu ở 100oC trong 30 phút - Rắc một lượng rất nhỏ mẫu lên môi trường HV Nuôi cấy ở 28oC trong 7-14 ngày - Một số phương pháp hóa phân loại xạ khuẩn: Chuẩn bị thành tế bào 1. Tế bào ướt (1-2 ml) + 5ml nước cất vô trùng + hạt thủy tinh (loại lớn và nhỏ, đường kính 0.11-0.12mm). Phá tế bào bằng sóng siêu âm ca.180 trong 1- 1.5 giờ cho đến khi dung dịch trở nên trong. Chuyển sang ống falcon 50ml. Nếu ngừng công việc ở đây, giữ mẫu ở 4oC. 2. Ly tâm với tốc độ 3000g trong 30 phút. Chuyển dịch trên sang ống ly tâm tốc độ cao (có nắp đậy bên trong). Ly tâm với tốc độ 17000rpm trong 30 phút. Bỏ dịch trên. 3. Thêm 3ml SDS 4% (SDS có tác dụng loại lipid và protein). Nếu dừng công việc ở đây, giữ mẫu ở nhiệt độ phòng. Giữ ở 100oC trong 40 phút, nhớ vặn chặt nắp. 4. 5. Ly tâm với tốc độ 17000 rpm trong 30 phút ở 30oC (nếu giữ ở nhiệt độ thấp, SDS sẽ bị kết tinh). Loại bỏ dịch trên. 6. Rửa với nước ít nhất 3 lần với điều kiện giống trên (17000rpm, 30 phút) 7. Nếu cần thiết, xử lý bằng RNase và DNase. 8. Đông khô qua đêm. Phân tích thành phần acid amin trong thành tế bào 1. 2-3mg thành tế bào + 200μl HCl 4N, vặn chặt nắp, giữ ở 100oC qua đêm 2. Làm khô bằng hút chân không (khoảng 1 ngày 1 đêm) 3. 4. Thêm 200 μl nước cất, trộn đều, chuyển sang ống eppendorf, ly tâm với tốc độ 12000 rpm trong 5 phút. Lọc mẫu. Chạy sắc ký bản mỏng TLC: - Dung môi: Methanol 80ml Nước cất 17.5ml 6N HCl 4ml Pyridine - Cellulose TLC - Chuẩn (1μl): DAP, Ala, Gly, Glu, Lys - Mẫu: 3-5μl - 5. - 10ml Nhận biết bằng phun ninhydrin, giữ ở 100oC trong 5 phút. Các acid amin sẽ hiện lên dưới dạng các chấm màu tím. Để lâu, các chấm này dần dần biến mất, nhưng riêng chấm của DAP sẽ chuyển sang màu vàng. Chuẩn bị mẫu chạy HPLC: chuẩn bị cho cả mẫu và chuẩn 10-20 μl (25nmol) mẫu, làm khô bằng hút chân không (khoảng 2h) - Thêm 20 μl Ethanol/DW/Triethylamine 2/2/1, trộn đều, làm khô bằng hút chân không (khoảng 2h) - Thêm 20 μl Ethanol/DW/Triethylamine/Phenylisothiocyanate 7/1/1/1, trộn đều, giữ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút, làm khô bằng hút chân không (khoảng 2h) - Thêm 0.5ml dung dịch A(dich chạy HPLC), lọc mẫu dùng làm mẫu chạy HPLC Điều kiện chạy HPLC - Độ hấp thụ (absorbance) 0.01 - Sử dụng UV detector ở bước sóng 254nm - Dung dịch A: 6% CH3CN, dung dịch B: 60% CH3CN - Tốc độ dòng chảy: 1ml/phút Chương trình Thời gian (phút) Nồng độ dung dịch B(%) 0 0 15 70 15.1 100 25 100 25.1 0 30 Dừng Phân tích thành phần menaquinone 1. 100-500mg tế bào khô + 10-15 ml Chloroform: methanol (2:1), trộn bằng khuấy từ chậm trong 2-3 giờ. 2. Chuyển sang ống falcon, ly tâm 3000 rpm trong 5-10 phút, lấy dịch trên, làm khô bằng cô quay 3. Hòa tan bằng 1,5 ml acetone, chuyển sang ống eppendorf, làm khô bằng hút chân không 4. Thêm 50 μl ethanol, chấm toàn bộ mẫu lên bản TLC silicagel, tránh ánh sáng và nhiệt độ cao( không làm khô mẫu bằng máy sấy). 5. Dung môi chạy TLC: Toluen. Sau đó, kiểm tra menaquinone bằng tia UV (thường nằm dưới vạch màu vàng có thể nhìn thấy bằng mắt thường). Chuẩn: Vitamin K. Vạch ngang với vitamin K là menaquinone. 6. Cạo vạch đã được nhận biết bằng UV, cho vào ống eppendorf, thêm 1,5ml acetone, trộn đều. 7. Ly tâm với tốc độ 3000 rpm trong 5 phút, lấy dịch trên, làm khô bằng Nitơ lỏng. 8. Thêm 50-100 μl ethanol, lọc và dùng làm mẫu chạy HPLC và Mass spectrometer (MS) 9. Điều kiện chạy HPLC - Dung môi: Methanol: Propanol (2:1) - Tốc độ dòng chảy: 0.2ml/min - Nhiệt độ cột: 40oC - Nhận biết bằng UV detector với bước sóng 275 nm Sau khi phân tích, ứng với mỗi pick trên LC, sẽ có pick trên MS. Chỉ số của MS chính là chỉ số m/z, sau đó trừ đi 1(vì MS thêm vào 1 proton), rồi so với giá trị trong bảng sẽ biết được là loại menaquinone nào. Quan trọng nhất là pick cuối cùng và cao nhất (vì menaquinone rất dễ bị đứt gãy). VD: MK-9 (H4) có nghĩa là menaquinone có chứa 9 đơn vị isoprene, trong đó có hai đơn vị isoprene bão hòa. Menaquinone này có thể bị đứt gãy dễ dàng nên xuất hiện các pick nhỏ hơn. Xạ khuẩn có MK 7,8,9,10,11. Một vài loại có MK12. Phân tích thành phần đường trong tế bào 1. 30-50mg tế bào khô + 1ml H2SO4 1N, lắc nhẹ, vặn chặt nút, giữ ở 100oC trong 2 giờ. 2. Để nguội, chuyển sang cốc thủy tinh, chỉnh pH 5.2-5.5 bằng dung dịch Ba(OH)4 bão hòa. 3. Chuyển sang ống eppendorf. Ly tâm với tốc độ 3000 rpm trong 5 phút, chuyển dịch trên sang cốc thủy tinh, làm khô bằng hút chân không 4. Hòa tan bằng 300 μl DW, chuyển sang ống eppendorf, ly tâm với tốc độ 3000rpm trong 5 phút, lấy dịch trên, lọc mẫu. 5. Chạy sắc ký bản mỏng TLC: - TLC cellulose - 3 μl mẫu - 1 μl chuẩn Chuẩn 1: galactose, arabinose, xylose 0.1% (w/v) hòa tan trong nước Chuẩn 2: rhamnose, mannose, glucose, ribose 0.1% (w/v) hòa tan trong nước Chuẩn 3: madurose (3-O-methyl-D-glucose) 0.1% (w/v) hòa tan trong nước - Dung môi chạy TLC: n-buthanol:water:pyridine:toluene= 10:6:6:1 (v/v) - Để khô, phun Acidity phthalate aniline (phtalic acid 3.25g hòa tan trong 100 ml dung dịch n-buthanol bão hòa, thêm 2ml aniline). Giữ ở 100oC trong 4 phút - Chuẩn bị dung dịch n-buthanol bão hòa: DW + n-buthanol (1:1), cho vào bình tách mẫu, lắc trộn đều, loại lớp dưới Chuẩn 1: Glucose: vàng Mannose: vàng Ribose: đỏ Rhamnose: vàng Chuẩn 2: Galactose: vàng Arabinose: đỏArabinose: đỏ Xylose: đỏ Chuẩn 3: Madurose: vàng 6. Điều kiện chạy HPLC: - Cột: cột trao đổi anion - Dung dịch A: Acid boric 0.1 M + Hòa tan 6,2g acid boric trong 1L DW + Thêm KOH 4M đến pH 8 - Dung dịch B: Acid boric 0.4M - + Hòa tan 24,8g acid boric trong 1L DW + Thêm KOH 4M đến pH 9 - Tốc độ dòng chảy: 0,5ml/min - Nhiệt độ: 65oC - Phản ứng nhận biết: Dung dịch C: 5g arginine + 15g acid boric trong 500ml DW Tốc độ dòng chảy: 0,5ml/min Nhiệt độ: 150oC Bước sóng: Ex=320nm, Em=430nm Chương trình Thời gian (phút) 100 65 Nồng độ Sol B 0 0 50 100 Dung dịch C: 0.2ml/min 57 57.1 0 dừng Phân tích thành phần acid béo 1. 5mg tế bào khô + dung dịch kiềm (R1) 1ml, vortex 5- 10 sec, giữ ở 100oC trong 5min, vortex 5-10 sec, giữ tiếp ở 100oC trong 25min, để nguội xuống nhiệt độ phòng, có thể đặt trực tiếp dưới vòi nước sau khi hạ xuống 80oC 2. Thêm dung dịch methyl hóa (R2): 2ml, giữ ở 80oC trong 10min, để nguội xuống nhiệt độ phòng. Quá trình này thấy xuất hiện khói trắng 3. Thêm dung dịch tách (R3) 3ml, đảo lộn đầu đuôi nhẹ nhàng trong10min, loại bỏ lớp dưới (lớp nước) 4. Thêm dịch rửa (R4) 3ml, đảo lộn đầu đuôi nhẹ nhàng trong 5 min, ly tâm 2000rpm trong 3min, chuyển 2/3 lớp trên (lớp dung môi) sang ống đựng mẫu (mẫu thường không màu) 5. Nếu lớp phía trên chưa trong, thêm 1-3 giọt dung dịch R5, đảo lộn đầu đuôi nhẹ nhàng trong 5min, ly tâm lại lần nữa. Chú ý: Các bước cần thực hiện liên tục, trước khi tiến hành cần chuẩn bị heatblock 100 and 80oC. R1: NaOH 15g, Methanol (HPLC grade) 50 mg, MQ 50ml R2: 6N HCl 65ml, Methanol (HPLC grade) 55ml, pH 1.5 R3: n-hexane (HPLC grade or n-hexane 1000) 50ml, methyl-ter-butyl ethel (HPLC grade) 50ml R4: NaOH 10.8g, MQ 900ml R5: 100ml MQ + 40g NaCl 6. Mẫu được phân tích bằng sắc ký khí (hệ thống MIDI) Phân tích thành phần phospholipid 1. 100mg tế bào khô + dung dịch chlorofolm: methanol: 0,3% NaCl (50:100:40) = 2ml: 4ml:1,6ml . Trộn bằng khuấy từ trong 4 giờ. Chuyển sang ống ống falcon, ly tâm 3000 rpm trong 5 phút. 2. Lấy dịch trên. Thêm 1,75ml NaCl 0.3% và 1,75ml chloroform. Lắc đều, ly tâm 5000 rpm trong 5 phút. Loại lớp trên cùng và lớp giữa. 3. Làm khô bằng Nitơ lỏng. Nếu ngừng công việc, giữ ở -20oC. 4. Hòa tan bằng 100 μl ethanol. 5. Chấm mẫu lên 4 bản HP-TLC (high performance) 6. Dung môi chạy TLC chiều 1: Chloroform: Methanol: Water = 65:25:4 Dung môi chạy TLC chiều 2: Trước khi chạy chiều 2, chấm Standard Chloroform: Acetic acid: Methanol: Water = 80:18:12:5 7. Nhận biết các loại phospholipid: Bản 1: Nhận biết các glycolipit: Chuẩn bị thuốc thử anisaldehyde: Acetic acid 1ml p-anisaldehyde 5ml H2SO4 Ethanol 5ml 90ml Phun thuốc thử, giữ ở 110oC trong 15 phút Các phospholipid chứa đường như GlcNU chứa NPG và PIMs, glycolipit sẽ hiện lên dưới dạng các chấm màu vàng xanh. Bản 2: Nhận biết các amino lipit Phun ninhydrin lên bản TLC. Giữ ở 120oC trong vài phút. - Các phospholipid chứa nhóm amino được nhận biết dưới dạng các chấm màu tím đỏ như PE, OH-PE, lyso-PE, PME, PS, NPG Nhận biết tất cả phospholipid bằng thuốc thử Dittmer Lester - Chuẩn bị thuốc thử Ditmer Lester: Sol I 25N H2SO4 100mg MoO3 4,011g Hòa tan bằng cách đun ở 90oC đến khi dung dịch trở nên trong SolII Iot 50mg Mo 0,178g Đun trong 15 phút, để nguội, lọc Trước khi dùng, trộn Sol I + Sol II (1:1) + 1 V nước rồi pha loãng 3 lần. Màu của dung dịch sẽ chuyển từ vàng sang xanh - Phun thuốc thử lên bản TLC, tất cả các phospholipid sẽ hiện lên Bản 3: Nhận biết các choline lipit - Thuốc thử Dragendorff: Sol A: Basic bismuth nitrate [Bi(OH)2NO3] Acetic acid Water 20ml 80ml Sol B: KI Nước 1,7g 10g 25ml Trước khi dùng, trộn 20ml Sol A và 5ml Sol B vào 70ml nước. - PC và sphingomyelin được nhận biết bằng chấm vàng da cam Bản 4: - Giữ bản TLC trong hộp chứa tinh thể Iot trong 3-5 phút. Các chấm vàng và nâu vàng sẽ xuất hiện. Phản ứng dùng để nhận biết tất cả các loại phospholipid. Những chấm vàng sẽ dần dần biến mất, có thể sử dụng bản này cho thí nghiệm tiếp theo. Nhận biết các glycolipit chứa nhóm OH - Thuốc thử Periodic acid: 1% natri metaperiodic Phun thuốc tử periodic acid lên bản TLC. Giữ trong 5-10 phút để nhóm glycol tách khỏi lipit bởi oxi hóa Phun nước (loại muối periodate) Đặt bản TLC vào bể chứa acid sulfuric cho đến khi các chấm vàng nhận biết bằng Iot biến mất. Phun thuốc thử Schiff PI hiện lên màu vàng, PG hiện lên màu đỏ đến tím, Các lipit chứa đường hiện lên màu xanh Phân tích thành phần G+C trong ADN 1. 25μl ADN (2-25μg), giữ ở 60oC trong 1 giờ. Giữ ở 100oC trong 2 phút. Làm lạnh lập tức trong chậu đá, spin down. 2. Mẫu ADN 25μl + đệm acetate (40mM, pH 5,3) chứa 2mM ZnSO4 25μl + dung dịch nuclease P1 (20U/ml) 25μl. Spin down. Giữ ở 37oC trong 1 giờ. 3. Glycine buffer (0,1 M, pH 10,4) 25 μl + alkaline phosphatase 2μl (0.35U/μl). Spin down. Giữ ở 37oC trong 1-2 giờ. Sử dụng làm mẫu chạy HPLC 4. Điều kiện HPLC: - Cột Cosmosil5 C18 - Nhiệt độ 35oC - Dung môi: 0,2M ammonium phosphat: acetonenitril (40:1) - Tốc độ dòng chảy: 1 ml/min - Bước sóng: 275nm Phương pháp tách ADN xạ khuẩn - Nuôi cấy lắc trong 5 ml môi trường dịch thể YG ở nhiệt độ 28oC - Lấy 1,5 ml dịch nuôi cấy, ly tâm với tốc độ 16000g trong 5 phút ở 4oC, thu sinh khối - Rửa bằng TE - Nghiền mẫu - Thêm 500 μl EDTA 5mM (pH 8,0), trộn đều - Thêm 50 μl lysozym (0,75 mg trong 1 ml Tris-HCl 10mM pH 8,0), trộn, giữ ở 37 oC trong 1 giờ - Thêm 50 μl SDS 20%, 50 μl proteinase K (4 mg trong 1 ml Tris-HCl 50mM pH 7,5), trộn, giữ ở 55oC trong 30 phút - Thêm 400 μl phenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1), trộn đều, ly tâm với tốc dộ 16000g trong 10 phút ở 4oC, thu lớp trên. Thực hiện 3 lần. - Thêm 1/10 thể tích Natriacetate 3M, 1 thể tích propanol, trộn đều - Thu ADN bằng đũa thủy tinh - Rửa trong 500 μl ethanol 70% trong 30 giây, để khô tự nhiên - Thêm 500 μl TE Nếu sử dụng mẫu ADN để tiến hành thí nghiệm lai ADN, cần làm tiếp các bước sau: - Thêm 50 μl RNase A (1 mg trong 1 ml Tris-HCl 50mM pH 7,5), 0,5 μl RNase T 1, giữ ở 37oC trong 20 phút Thêm 50 μl proteinase K, giữ ở 37oC trong 1 giờ Thêm 400 μl phenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1), trộn đều, ly tâm với tốc dộ 16000g trong 10 phút ở 4oC, thu lớp trên. Thực hiện 3-4 lần. - Thêm 1/10 thể tích Natriacetate 3M, 1 thể tích propanol, trộn đều - Thu ADN bằng đũa thủy tinh - Rửa trong 500 μl ethanol 70% trong 30 giây, để khô tự nhiên - Thêm 100-200 μl TE Các số liệu trên được lấy từ sách Bergey’s manual systematic of bacteriology và sách Identification manual of actinomycetes. Tài liệu tham khảo: 1. Miyadoh S. (ed.). 1997. Atlas of actinomycetes. Asakura Publishing Co. Ltd, Japan. 2. Miyadoh S. (ed.). 2001. Identification manual of actinomycetes. Business Center for Academic Societies Japan. 3. Williams S. T.,M.E. Sharpe , J.G. Holt (ed.). 1989. Bergey’s manual of systematic bacteriology. Williams & Wilkins, Baltimore, USA. Holt J.G, N.R.Krieg, P.H.A.Sneath, J.T.Staley, S.T.Williams.2000. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (9th edition). Lippincott Williams & Wilkins