Nội dung

Bài 5 Cổ khuẩn(Archaea) Phân loại cổ khuẩn Mở đầu Những vi sinh vật có khả năng sinh methane (mêtan), mẫn cảm với oxygen và có cấu trúc màng tế bào đặc biệt đã được biết đến từ lâu nhưng mãi đến cuối những năm 1970 chúng mới được nhìn nhận như đại diện của một dạng sống thứ ba trên trái đất bên cạnh vi khuẩn và sinh vật nhân thật, đó là cổ khuẩn. Carl R. Woese và cộng sự (1977) sau khi xem xét trình tự 16S rARN nhận thấy rằng các sinh vật nhân nguyên thuỷ (Prokaryote) cần được chia thành hai nhóm khác biệt nhau hoàn toàn là Vi khuẩn (Eubacteria hay Bacteria) và Cổ khuẩn (Archaeabacteria hay Archaea), và cùng với các Sinh vật nhân thật (Eukarya) làm thành ba lĩnh giới (Domains) ở sinh vật (Hình 1). Các nghiên cứu sâu hơn về phả hệ và đặc điểm sinh lý sinh hoá cho thấy rằng cổ khuẩn được tách ra từ rất sớm trong quá trình tiến hoá, chúng không gần vi khuẩn nhiều hơn so với sinh vật nhân thật, do vậy tên gọi Archaea được đề xuất thay cho Archaeabacteria. Hiện nay cả hai tên gọi Archaea và Archaeabacteria đều được sử dụng trong các tài liệu vi sinh vật, tuy nhiên thuật ngữ Archaea chính xác hơn vì rõ ràng cổ khuẩn không phải vi khuẩn mà là một nhóm vi sinh vật riêng biệt. Hình 1. Ba lĩnh giới của sinh vật: Vi khuẩn (Bacteria), Cổ khuẩn (Archaea) và Sinh vật nhân thật (Eukarya). Cổ khuẩn là một nhóm vi sinh vật đặc biệt Cổ khuẩn (Archaea) bắt nguồn từ tiếng La tinh Archaios có nghĩa là cổ, là một nhóm vi sinh vật có nhiều đặc điểm rất khác biệt (Bảng 1). Bảng 1. Những đặc điểm khác biệt của cổ khuẩn so với vi khuẩn và sinh vật nhân thật Đặc điểm Vi khuẩn (Bacteria) Cổ khuẩn(Archaea) Sinh vật nhân thật (Eukarya) Thành tế bào Peptidoglycan Pseudo-peptidoglycan, protein, polysaccharid, glycoprotein cellulose, carbonat, silicat, chitin… Màng tế bào Este-lipid Ete-lipid Este-lipid Chỉ có một loại Có nhiều loại Có ba loại 4 đơn vị 2’ 7  12 đơn vị 7  12 đơn vị 70 S 70 S 80 S Mẫn cảm Mẫn cảm ARN polymeraza (trên khuôn ADN) Ribosom Phản ứng của ribosom Đề kháng với độc tố bạch hầu Cũng như tế bào vi khuẩn, tế bào cổ khuẩn (ngoại trừ chi Thermoplasma) có thành tế bào bên ngoài giữ chức năng bảo vệ. Tuy nhiên, không như ở vi khuẩn, thành tế bào của cổ khuẩn không chứa peptidoglycan và vì thế không bị phá huỷ dưới tác dụng của lysozym. Cổ khuẩn có rất nhiều dạng cấu trúc thành tế bào khác nhau. Một số cổ khuẩn (như các loài sinh methane) có thành tế bào cấu tạo bởi một loại polysaccharid rất giống với peptidoglycan được gọi là pseudopeptidoglycan (pseudomurein). Chuỗi pseudo-peptidoglycan gồm các đơn nguyên N-acetylglucosamin và N-acetyl-alosamin-uronic acid (thay cho N-acetyl-muramic acid trong peptidoglycan). Ngoài ra, ở đây cầu nối glycosid 13 thay thế cho cầu nối glycosid 14 ở peptidoglycan. Một số cổ khuẩn khác lại hoàn toàn không có cả peptidoglycan và pseudopeptidoglycan trong thành tế bào mà thay vào đó là hỗn hợp gồm polysaccharid, glycoprotein hoặc protein. Ví dụ như các loài Methanosarcina (cổ khuẩn sinh methane) có thành tế bào là một lớp polysaccharid dày cấu tạo từ glucoza, glucuronic acid, galactosamin và acetat. Các loài cổ khuẩn ưa mặn cực đoan (extreme halophiles) như là Halococcus có thành tế bào tương tự như Methanosarcina nhưng chứa nhiều hợp chất có nhóm sulfat giống như chondroitin sulfat ở tổ chức liên kết của động vật. Dạng cấu trúc thành tế bào phổ biến nhất ở cổ khuẩn là lớp paracrystallin bề mặt (S-layer) gồm protein hay glycoprotein. Cấu trúc này được tìm thấy ở các đại diện thuộc tất cả các nhóm cổ khuẩn, từ ưa mặn cực đoan (extremely halophilic), ưa nhiệt cực đoan (extremely thermophilic) và cả các loài sinh methane. Đặc biệt các chi Methanospirillum và Methanothrix (cổ khuẩn sinh methane) có cấu trúc thành tế bào vô cùng phức tạp. Các loài thuộc hai chi này mọc thành chuỗi dài gồm nhiều tế bào, ở giữa mỗi cặp tế bào có một lớp đệm dày và toàn bộ cấu trúc chuỗi đó lại được bọc kín trong một lớp paracrystallin bề mặt. Thành phần và cấu trúc lipid của màng tế bào là một trong những đặc điểm nổi bật phân biệt cổ khuẩn và hai nhóm còn lại. Trong khi ở vi khuẩn và sinh vật nhân thật cầu nối acid béoglycerol trong lipid màng tế bào là liên kết este (ester) thì ở cổ khuẩn lại là liên kết ete (ether) (Hình 2). Acid béo trong este-lipid thường là các phân tử ngắn, mạch thẳng. Trái lại, acid béo trong ete-lipid là các phân tử mạch dài, phân nhánh, thuộc cả hai dạng phytanyl (C20cacbuahydro tổng hợp từ isopren) và biphytanyl (C40). Do chỉ có ở cổ khuẩn và không bị biến đổi dưới nhiệt độ cao nên isopren-lipid được lấy làm chất chỉ thị của cổ khuẩn hoá thạch. Enzyme polymeraza thực hiện quá trình sao mã trên khuôn ADN (DNA-dependent RNA polymerase) ở ba lĩnh giới sinh vật cũng có nhiều điểm khác nhau. Vi khuẩn chỉ có một loại ARNpolymeraza có cấu trúc không gian đơn giản, gồm bốn chuỗi polypeptid 2, 1, 1’ và một nhân tố  không cố định. Cổ khuẩn có nhiều loại ARNpolymeraza, cấu trúc mỗi loại lại phức tạp hơn nhiều so với ARN-polymeraza vi khuẩn. ARNpolymeraza của cổ khuẩn sinh methane và các loài Hình 2. Lipid ưa mặn (halophilic) gồm tám chuỗi polypeptid (5 trong màng tế chuỗi dài và 3 chuỗi ngắn). ARN-polymeraza ở cổ bào của cổ khuẩn ưa nhiệt cao (hyper-thermophilic) lại phức khuẩn (ete-lipid) tạp hơn, gồm ít nhất 10 chuỗi peptid. Polymeraza khác với của vi khuẩn và sinh thực hiện quá trình tổng hợp ARN thông tin vật nhân thật (mARN) ở sinh vật nhân thật gồm 10-12 chuỗi (este-lipid) polypeptid có kích thước tương tự như ở ARNpolymeraza của cổ khuẩn ưa nhiệt cao. Ngoài ra, sinh vật nhân thật còn có hai loại ARN-polymeraza khác nữa đặc hiệu cho quá trình tổng hợp ARN của ribosom (rARN) và ARN vận chuyển (tARN). Như vậy chất kháng sinh rifampicin có tác dụng ức chế đơn vị  của polymeraza chỉ có hiệu quả đối với vi khuẩn vì cổ khuẩn và sinh vật nhân thật không có loại polymeraza này. Với những điểm khác biệt trong trình tự 16S rARN cũng như cấu trúc ARN-polymeraza, hiển nhiên bộ máy sinh tổng hợp protein của ba lĩnh giới sinh vật cũng sẽ không đồng nhất. Tuy có kích thước của ribosom giống với vi khuẩn (70S) nhưng cổ khuẩn lại có nhiều bước trong quá trình sinh tổng hợp protein rất giống với sinh vật nhân thật (80S ribosom). Nhiều chất kháng sinh ức chế quá trình sinh tổng hợp protein ở vi khuẩn lại không có hiệu lực đối với cổ khuẩn và sinh vật nhân thật (Bảng 2). Ngoài ra, tương tự như ở sinh vật nhân thật, nhân tố kéo dài EF-2 trong ribosom ở cổ khuẩn có phản ứng với độc tố bạch hầu, một loại độc tố vô hại đối với vi khuẩn. Tuy nhiên nhân tố EF-2 ở cổ khuẩn mang tính đặc hiệu cao, nhân tố này hoàn toàn không hoạt động trong môi trường ribosom của vi khuẩn hoặc sinh vật nhân thật. Các thí nghiệm lai ribosom in vitro cho thấy ribosom ghép giữa đơn vị lớn (50S) của cổ khuẩn và đơn vị nhỏ (40S) của sinh vật nhân thật vẫn thức hiện chức năng giải mã một cách bình thường, trong khi đó việc ghép tương tự giữa vi khuẩn và sinh vật nhân thật lại hoàn toàn không tương thích. Như vậy cấu trúc bộ máy sinh tổng hợp protein của cổ khuẩn có nhiều điểm tương đồng với sinh vật nhân thật hơn là với vi khuẩn. Giống như vi khuẩn, cổ khuẩn có một nhiễm sắc thể dạng vòng, tuy nhiên genom của cổ khuẩn thường nhỏ hơn nhiều so với genom của vi khuẩn. Chẳng hạn ADN của Escherichia coli là 2,5 x 109 Da, trong khi đó ADN của Thermoplasma acidophilum là 0,8 x 109 Da, hay của Methanobacterium là 1,1 x 109 Da. Ngoài ra thành phần GC (mol%) của ADN ở cổ khuẩn dao động trong phạm vi rất lớn, từ 21 đến 68 %, chứng tỏ tính đa dạng của cổ khuẩn. So sánh trình tự đầy đủ của genom ở cổ khuẩn Methanococcus jannaschi với genom của vi khuẩn và sinh vật nhân thật cho thấy 56% trong 1738 gen không tương đồng. Bảng 2. Tính mẫn cảm của đại diện ba lĩnh giới sinh vật đối với các chất ức chế quá trình sinh tổng hợp protein Chất kháng sinhTác dụng ức chế Cổ khuẩn Methanobacterium  Cycloheximid Ức chế bước khởi đầu Virginiamycin, Ức chế bước kéo + pulvomycin dài Neomycin, Dừng tổng hợp sớm + puromycin  Rifamycin Ức chế enzyme ARN polymeraza  Erythromycin, Tăng tần số mắc lỗi streptomycin, và một số hiệu ứng chloramfenicol khác Sulfolobus  Vi khuẩn Sinh vật nhân thật Escheri- Saccharomyces chia coli cerevisae  +  +  + + +  +   +  Các hình thức dinh dưỡng ở cổ khuẩn Cổ khuẩn có nhiều hình thức dinh dưỡng: hoá dưỡng hữu cơ (chemoorganotrophy), hoá dưỡng vô cơ (chemolithotrophy), tự dưỡng (autotrophy), hay quang hợp (phototrophy). Hoá dưỡng hữu cơ là hình thức dinh dưỡng của nhiều loài cổ khuẩn, tuy nhiên các chu trình phân giải chất hữu cơ thường có một số điểm khác biệt so với vi khuẩn. Cổ khuẩn ưa mặn (halophiles) và ưa nhiệt cực đoan (extreme thermophiles) phân giải glucoza theo một dạng cải biên của con đường Entner-Doudoroff (E-D). Nhiều loài cổ khuẩn lại có khả năng sản sinh ra glucoza từ các chất ban đầu không phải là hydratcarbo (gluconeogenesis) thông qua các bước đảo ngược của quá trình glycolysis (con đường Embden-Meyerhof). Oxygen hoá acetat thành CO2 được thực hiện qua chu trình TCA (đôi khi với một số thay đổi trong các bước phản ứng), hoặc qua con đường acetyl-CoA (Ljungdahl-Wood). Các thành phần của chuỗi vận chuyển điện tử như ở vi khuẩn đều được tìm thấy ở cổ khuẩn, trong đó cytochroma, b và c có ở các loài ưa mặn cực đại, cytochroma có ở một số loài ưa nhiệt cao. Mô phỏng dựa trên chuỗi chuyển điện tử ở phần lớn cổ khuẩn cho thấy chúng thu nạp điện tử từ chất cho vào chuỗi ở nấc thang NADH, oxygen hoá chất nhận điện tử cuối cùng là O 2, S0 hay một số chất khác, đồng thời tạo ra lực đẩy proton (proton motiv force) để tổng hợp ATP nhờ bộ máy ATPaza khư trú trong màng tế bào. Hoá dưỡng vô cơ khá phổ biến ở cổ khuẩn, trong đó hydro thường được sử dụng làm chất cho điện tử. Tự dưỡng đặc biệt phổ biến ở cổ khuẩn và diễn ra dưới nhiều hình thức khác nhau. Ở cổ khuẩn sinh methane và cổ khuẩn hoá dưỡng vô cơ ưa nhiệt cao CO 2 được chuyển hoá thành các hợp chất hữu cơ qua con đường acetyl-CoA, trong đó một số loài có cải biên ở các bước phản ứng khác nhau. Một số loài cổ khuẩn khác (như Thermoproteus) cố định CO2 theo chu trình citric acid đảo ngược, tương tự như ở vi khuẩn lam lưu huỳnh. Mặc dù các loài cổ khuẩn ưa nhiệt cực đoan đều thực hiện hình thức dinh dưỡng hữu cơ nhưng nhiều loài vẫn có khả năng cố định CO 2 và thực hiện quá trình này theo chu trình Calvin, tương tự như ở vi khuẩn và sinh vật nhân thật. Khả năng quang hợp có ở một số loài cổ khuẩn ưa mặn cực đoan, tuy nhiên khác với vi khuẩn, quá trình này được thực hiện hoàn toàn không có sự tham gia của chlorophill hay bacteriochlorophill mà nhờ một loại protein ở màng tế bào là bacteriorhodopsin kết gắn với phân tử tương tự như carotenoid có khả năng hấp phụ ánh sáng, xúc tác cho quá trình chuyển proton qua màng nguyên sinh chất và sử dụng để tổng hợp ATP. Tuy nhiên, bằng hình thức quang hợp này cổ khuẩn ưa mặn cực đoan chỉ có thể sinh trưởng với tốc độ thấp trong điều kiện kỵ khí, khi môi trường thiếu chất dinh dưỡng hữu cơ. Môi trường sống của cổ khuẩn và giả thuyết về hình thành sự sống trên trái đất Cổ khuẩn được biết đến như những vi sinh vật thích nghi với các môi trường có điều kiện cực đoan (extreme) như nhiệt độ cao (thermophilic), nơi lạnh giá (psychrophilic), nồng độ muối cao (halophilic) hay độ acid cao (acidophilic) v.v. Đó cũng là một lý do giải thích tại sao cổ khuẩn lại khó được phân lập và nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm. Trong giới sinh vật, cổ khuẩn có các đại diện cư trú ở các điều kiện nhiệt độ cao hơn cả (Bảng 3, Hình 3), nhiều loài có thể sống ở nhiệt độ trên 100 C dưới áp suất cao như ở các miệng núi lửa dưới đáy đại dương. Cơ chế thích nghi của tế bào vi sinh vật với nhiệt độ cao như vậy còn đang được nghiên cứu. Ở cổ khuẩn, một số phương thức thích nghi với nhiệt độ cao được biết đến như tác dụng của enzyme gyraza trong việc bảo vệ cấu trúc xoắn của ADN dưới tác động của nhiệt, hay ete-lipid, nhất là C 40-lipid trong màng tế bào của cổ khuẩn, giúp làm tăng đô bền vững của màng. Tuy nhiên cổ khuẩn không chỉ sống ở các môi trường cực đoan. Ngoài đại dương cổ khuẩn tồn tại với một số lượng lớn. Trên đất liền các loài cổ khuẩn sinh methane ưa ấm có mặt ở nhiều môi trường khác nhau, như các bể lên men chất thải hữu cơ, các chân ruộng lúa ngập nước, đường tiêu hoá của động vật v.v. Bảng 3. Nhiệt độ phát triển cao nhất của các đại diện sinh vật trên trái đất Cá 38 C Côn trùng 50 Động vật đơn bào 50 Tảo 56 Nấm 60 Vi khuẩn thường Cổ khuẩn 90 113 Khả năng thích nghi đối với các điều kiện sống cực đoan của cổ khuẩn là cơ sở để giả thuyết rằng chúng là những sinh vật sống đầu tiên xuất hiện trên trái đất. Trái đất của chúng ta trong thời kỳ đầu có nhiệt độ rất cao, khoảng 100 C trở lên, chứa nhiều ammon và khí methane trong khí quyển, do vậy những dạng sống đầu tiên phải là các sinh vật yếm khí và ưa nhiệt cao (hyperthermophiles). Với các đặc điểm sinh lý như tính ưa nhiệt, sống kỵ khí, sử dụng các chất hữu cơ và vô cơ là nguồn năng lượng, các loài cổ khuẩn ưa nhiệt cao có lẽ phù hợp với dạng sống nguyên thuỷ mô phỏng theo điều kiện của trái đất trong thời kỳ đầu. Trong thực tế, chất chỉ thị mạch isoprenelipid thành phần màng tế bào của cổ khuẩn được tìm thấy trong các lớp trầm tích có tuổi là 3,8 tỷ năm. Các nghiên cứu dựa trên trình tự 16S rARN cho thấy cổ khuẩn, đặc biệt là nhóm cổ khuẩn ưa nhiệt cao, tiến hoá chậm hơn đáng kể so với vi khuẩn và sinh vật nhân thật. Tuy nhiên tốc độ tiến hoá chậm của cổ khuẩn so với hai lĩnh giới còn lại có thể do môi trường sống khắc nghiệt của chúng tạo ra. Cho đến nay câu hỏi về nguồn gốc sự sống và vai trò của cổ khuẩn trong đó vẫn còn đang tiếp tục được tranh luận. Hình 3. Một trong những nơi đầu tiên cổ khuẩn được tìm thấy: suối nước nóng trong công viên Quốc gia Yellowstone (Mỹ). Phả hệ cổ khuẩn dựa trên trình tự 16S rARN Dựa trên so sánh trình tự 16S rARN các đại diện cổ khuẩn đã phân lập được chia thành hai nhóm chính là Euryarchaeota và Crenarchaeota (Hình 4,5). Euryarchaeota là nhóm cổ khuẩn được biết rõ nhất, bao gồm nhiều loài sinh methane, cổ khuẩn ưa mặn, khử sulfat (Archaeoglobales), Thermoplasmalates và Thermococcales. Nhóm Crenarchaeota gồm ba lớp Desulfococcales, Sulfolobales và Thermoproteales. Sau này nhóm cổ khuẩn Korarchaeota được đề xuất thêm (Hình 6), tuy nhiên chỉ dựa trên các trình tự 16S rADN có được từ các mẫu ADN tách trực tiếp từ môi trường chứ chưa có đại diện nào được phân lập và nuôi cấy trong phòng thí nghiệm. Hình 4. Các đại diện của hai nhóm cổ khuẩn Crenarchaeota và Euryarchaeota. Hình 5. Hình thái một số đại diện của hai nhóm cổ khuẩn Euryarchaeota và Crenarchaeota Hình 6 Mối liên quan phả hệ của ba nhóm cổ khuẩn Euryarchaeota và Crenarchaeota và Korarchaeota Hình 7 Nanoarchaeum equitans (cầu khuẩn nhỏ) trên bề mặt Ignicoccus sp. (cầu khuẩn lớn) Gần đây (2002), nhóm nghiên cứu của giáo sư Stetter, một trong những nhà nghiên cứu cổ khuẩn hàng đầu thế giới, công bố sự hiện diện của nhóm cổ khuẩn thứ tư, Nanoarchaeota, gồm những cổ khuẩn có kích thước rất nhỏ với một đại diện duy nhất được tìm thấy là Nanoarchaeum equitans (Hình 7). Loài cổ khuẩn này có tế bào hình cầu, đường kính 400 nm, sống bám trên bề mặt tế bào của một loài cổ khuẩn mới Ignicoccus sp., phân lập từ mẫu nước nóng ở độ sâu 106 m dưới đáy biển. Đây là một loài ưa nhiệt cực đoan, phát triển ở nhiệt độ tối ưu 75-98 C. Nhiều trình tự 16S rARDN trực tiếp có được từ môi trường có nhiệt độ cao cũng khẳng định sự tồn tại và khác biệt của nhóm Nanoarchaeota so với các nhóm cổ khuẩn còn lại. Đa dạng và các nhóm cổ khuẩn đại diện Xét về các đặc điểm sinh lý, cổ khuẩn có thể phân thành bốn nhóm chính là sinh methane (methanogens), cổ khuẩn ưa nhiệt cao (hyper-therrmophiles), cổ khuẩn ưa mặn (halophiles) và cổ khuẩn ưa acid (acidophiles) thuộc lớp Thermoplasmatales với nhiều đại diện đã được phân lập và nghiên cứu trong phòng thí nghiệm (Hình 8). Hình 8. Đại diện các nhóm cổ khuẩn chính Cổ khuẩn sinh methane (methanogens) Trong cổ khuẩn, các loài sinh methane làm thành một nhóm lớn và đa dạng với các đặc điểm chung là (1) tạo khí methane như sản phẩm cuối cùng của chu trình trao đổi năng lượng và (2) sống kỵ khí bắt buộc. Cổ khuẩn sinh methane thu năng lượng cho quá trình sinh trưởng từ việc chuyển hoá một số chất thành khí methane. Nguồn cơ chất chủ yếu của các vi sinh vật này là hydro, format và acetat. Ngoài ra, một số hợp chất C1 như metanol, trimethylamin, dimethylsulfid và rượu như isopropanol, isobutanol, cyclopentanol, etanol cũng được sử dụng làm cơ chất (Bảng 4). Quá trình sinh methane ở cổ khuẩn có thể coi như là quá trình hô hấp kỵ khí, trong đó chất nhận điện tử là CO2 hoặc nhóm methyl trong các hợp chất C1 và acetat. Tuy nhiên, như ta thấy trong bảng 4, năng lượng được giải phóng ra trong các phản ứng tạo methane đều rất nhỏ. Để so sánh ta có thể lấy năng lượng giải phóng từ phản ứng oxygen hoá glucoza bằng oxygen C 6H12O6 + 6 O2  6 CO2 + 6 H2O (∆G0’ = 2870 kJ/mol). Là những sinh vật duy nhất có khả năng tạo ra khí methane, cổ khuẩn sinh methane có những enzyme và coenzyme thiết yếu cho quá trình tổng hợp methane và đóng vai trò chỉ thị cho nhóm, ví dụ như coenzyme F420 và coenzyme M. Sự hiện diện của coenzyme F420 khiến cho các tế bào của cổ khuẩn sinh methane có tính tự phát sáng dưới ánh đèn huỳnh quang (bước sóng 350420 nm). Mặc dù hiện tượng tự phát sáng này có thể mạnh, yếu, hay đôi khi mất hẳn, tuỳ thuộc vào các pha sinh trưởng của tế bào, nhưng đó vẫn là một đặc điểm đơn giản và tiện lợi để nhận biết cổ khuẩn sinh methane dưới kính hiển vi. Bên cạnh đó, trình tự acid amin trong các chuỗi peptid của coenzyme M cũng được dùng để phân loại cổ khuẩn sinh methane. Những nghiên cứu trong lĩnh vực này cho thấy sự tương đồng giữa cây phân loại dựa trên trình tự 16S rARN và cây phân loại dựa trên trình tự acid amin của các đơn vị  và  trong coenzyme M. Bảng 4. Phản ứng tạo methane trên các cơ chất khác nhau và năng lượng được giải phóng từ đó Phản ứng sinh methane 4H2 + CO2  CH4 + 2H2O 4 Format  CH4 + 3CO2 + 2H2O 4 Isopropanol + CO2  CH4 + 4 Aceton + 2H2O 2 Etanol + CO2  CH4 + 2 Acetat Metanol + H2  CH4 + H2O 4 Metanol  3CH4 + CO2 + 2H2O 4 Methylamin + 2H2O  3CH4 + CO2 + 4NH4+ 2 Dimethylamin + 2H2O  3CH4 + CO2 + 2 NH4+ 4 Trimethylamin + 6H2O  9 CH4 + 3CO2 + 4 NH4+ 2 Dimethylsulfid + 2H2O  3CH4 + CO2 + H2S Acetat  CH4 + CO2 Năng lượng được giải phóng G0’ (kJ/ methane) 135,6 130,1  36,5 116,3 112,5 104,9  75,0  73,2  74,3  73,8  31,0 Những nơi thông thường có thể tìm thấy cổ khuẩn sinh methane là các bể lên men hữu cơ kỵ khí, các lớp trầm tích thiếu oxygen, đất ngập úng và hệ đường ruột của động vật. Khi ở dạng chủng đơn cổ khuẩn sinh methane rất nhạy cảm với oxygen, tuy vậy trong tự nhiên chúng có thể tồn tại ở môi trường hiếu khí nhờ được bao bọc và bảo vệ bởi các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí khác. Trong môi trường kỵ khí, cổ khuẩn sinh methane phải cạnh tranh về cơ chất, đặc biệt là hydro và acetat, với các nhóm vi sinh vật sử dụng chất nhận điện tử có hiệu điện thế khử dương tính hơn so với CO 2 như là nitơrat, sulfat và ôxit sắt III. Như vậy cổ khuẩn sinh methane sẽ chiễm lĩnh các môi trường nơi không có nhiều các loại chất nhận điện tử tiềm năng này. Do không có khả năng sử dụng rộng rãi các loại cơ chất khác nhau, trong tự nhiên cổ khuẩn sinh methane thường phải phụ thuộc vào các loài vi khuẩn lên men vì chúng chuyển hoá đa dạng chất hữu cơ thành các acid hữu cơ, hydro, format và acetate, trong đó hydro, format và acetate là nguồn thức ăn trực tiếp cho cổ khuẩn sinh methane, còn các acid hữu cơ sản phẩm của quá trình lên men như propyonat, butyrate thì cần phải được một nhóm vi khuẩn khác chuyển hoá thành cơ chất thích hợp rồi mới đến lượt cổ khuẩn chuyển thành khí methane. Có hai hình thức cộng sinh: bắt buộc và không bắt buộc. Trong hình thức cộng sinh giữa cổ khuẩn sinh methane và vi khuẩn lên men, chỉ có cổ khuẩn phụ thuộc vào mối liên hệ này do nhu cầu về thức ăn còn các hoạt động trao đổi chất của chúng hoàn toàn không có ảnh hưởng gì tới các vi khuẩn lên men, vì thế hình thức này được gọi là cộng sinh không bắt buộc. Cộng sinh bắt buộc diễn ra giữa cổ khuẩn sinh methane và một nhóm vi khuẩn cộng sinh bắt buộc, trong đó cả đôi bên cùng cần đến nhau, ví dụ như hiện tượng cộng sinh giữa Methanobrevibacter và Synthrophobacter (Hình 9). Nhóm vi khuẩn cộng sinh trong mối liên kết này oxygen hoá acid hữu cơ như propionate, các acid có mạch carbon dài hơn, các hợp chất thơm và chuyển điện tử sang proton hay CO 2, tạo thành hydro hay format tương ứng. Nhóm vi khuẩn cộng sinh này chỉ có thể thực hiện được trao đổi chất khi nồng độ hydro và format trong môi trường xung quanh được giữ ở mức rất thấp, và nhiệm vụ đó do cổ khuẩn sinh methane đảm nhiệm. Các loài sinh methane thường có mặt trong mối liên kết cộng sinh bắt buộc là Methanoplanus endosymbiosus, các loài Methanobrevibacter, và Methanobacterium formicicum. Hình 9 : Cộng sinh giữa Methanobrevibacter (tế bào trực khuẩn) và Synthrophobacter (tế bào hình oval). Ở một số môi trường đặc biệt như các suối nước nóng hay các tầng nham thạch núi lửa cổ khuẩn sinh methane thường có mặt với số lượng lớn. Trong trường hợp này chúng sống tự do, không phụ thuộc vào các vi sinh vật khác vì nguồn cơ chất chủ yếu được sử dụng ở đây là hydro, sản phẩm có được từ con đường lý hoá chứ không qua con đường sinh học. Hiện nay tổng số cổ khuẩn sinh methane được biết đến là 50 loài thuộc 19 chi, sáu họ và ba lớp (Bảng 5 và 6). Sự phân loại này dựa trên trình tự 16S rARN hiện có, tuy nhiên chúng ta có thể hình dung được rằng theo thời gian khi những loài mới được biết thêm thì có thể bảng phân loại này sẽ cần phải thay đổi. Bảng 5. Các nhóm phân loại chính của cổ khuẩn sinh methane Lớp Methanobacteriales -nt- Họ Methanobacteriaceae (T) -nt- Chi Methanobacterium (T) Methanobrevibacter -nt-ntMethanococcales Methanomicrobiales -nt-nt-nt-nt-nt-nt-nt-nt-nt-nt-nt-nt-nt- -ntMethanothermaceae Methanococcaeae (T) Methanosarcinaceae -nt-nt-nt-nt-nt-ntMethanomicrobiacaea (T) -nt-nt-nt-nt-ntMethanocorpusculaceae Methanosphaera Methanothermus (T) Methanococcus (T) Halomethanococcus Methanococcoides Methanohalobium Methanohalophilus Methanolobus Methanosarcina (T) Methanosaeta (Methanothrix) Methanoculleus Methanogenium Methanolacinia Methanomicrobium (T) Methanoplanus Methanospirillum Methanocorpusculum (T) T = họ/ chi chuẩn; -nt- như trên Về hình thái, cổ khuẩn sinh methane rất đa dạng, trong đó một số loài có hình dạng đặc trưng dễ nhận biết dưới kính hiển vi như Methanosarcina, Methanospirillum hay Methanosaeta (Hình 10). Ngoài ra, một trong những đặc điểm quan trọng dùng để phân loại nhóm cổ khuẩn này là nguồn cơ chất có thể sử dụng để sinh methane (Bảng 6). Họ Methanobacteriaceae có thành tế bào cấu tạo từ pseudomurein, vì thế bắt mầu Gram (+). Họ Methanobacteriaceae gồm có ba chi là Methanobacterium, Methanobrevibacter và Methanosphaera. Các loài thuộc chi Methanobacterium có tế bào hình que hoặc hình sợi, đôi khi tạo nhóm gồm nhiều tế bào. Tất cả các loài thuộc chi này đều có khả năng sinh methane từ H2 + CO2, một số loài sử dụng. Bài 6 Phương pháp thực nghiệm dùng để định tên các loài vi khuẩn 1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI: 1.1. Nhuộm Gram (phương pháp Hucker cải tiến) Vật liệu, hoá chất:  Dung dịch Tím kết tinh (Crystal violet): 2g tím kết tinh hoà tan trong 20 ml etanol 95% 0,8 g ammon oxalat hoà tan trong 80 ml nước cất Trộn hai dịch nói trên lại với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc. Bảo quản trong lọ tối, sử dụng vài tháng.  Dung dịch Iod: Hoà tan 1 g Iod (Iodine) trong 3-5ml nước cất, thêm 2g KI (Kali iodide), khuấy cho tan hết, thêm nước cất cho đủ 300ml. Bảo quản trong lọ tối.  Dung dịch tẩy màu: Etanol 95% hoặc trộn hỗn hợp 70ml etanol 95% với 30ml aceton.  Dung dịch nhuộm bổ sung: Chuẩn bị sẵn dung dịch Safranin O 2,5%, trước khi dùng pha với nước cất theo tỷ lệ 1:5 (vol/vol) để có dung dịch 0,5%. Các bước tiến hành:  Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí.  Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.  Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.  Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.  Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô.  Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong không khí.  Soi kính: dùng vật kính dầu 100. Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram () bắt màu đỏ. Hình 1.1. 1.2. Các bước tiến hành nhuộm Gram và ví dụ minh hoạ kết quả. Nhuộm tiên mao Vật liệu, hoá chất:  Dung dịch A: Acid tannic 5g FeCl3 1,5 g Formalin 2 ml NaOH 1% 1 ml Nước cất 100 ml  Dung dịch B: 2 g AgNO3 hoà tan trong 100 ml nước cất, lấy 10 ml dể riêng. Nhỏ dung dịch NH4OH đậm đặc vào 90 ml còn lại, thấy hình thành tủa rất đặc, tiếp tục nhỏ NH4OH vào cho đến khi tan hết tủa. Lấy 10ml AgNO 3 đã bỏ ra ban đầu nhỏ từ từ vào dung dịch, thấy xuất hiện váng mỏng, tiếp tục nhỏ vào cho đến khi vừa tan hết váng thì thôi.  Chuẩn bị phiến kính: rửa thật sạch, ngâm trong cồn, đốt cháy hết cồn rồi mới sử dụng. Các bước tiến hành:  Hoạt hoá vi khuẩn 2-3 lần trước khi tiến hành nhuộm.  Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ mặt thạch (mới cấy 18-24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất đặt giữa phiến kính, để nghiêng cho chảy về một phía, làm khô trong không khí.  Cố định tế bào: hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.  Nhỏ dịch A lên vết bôi, giữ 10 phút, rửa bằng nước cất.   Dùng dịch B cho chảy qua để loại hết nước. Nhuộm bằng dịch B trong 30-60 giây. Hơ nóng, để nguội rồi rửa lại bằng nước cất. Soi kính: dùng vật kính dầu 100. Kết quả: Tế bào vi khuẩn bắt màu nâu thẫm, tiên mao bắt màu nâu. Hình 1.2. 1.3. Ví dụ minh hoạ kết quả nhuộm tế bào vi khuẩn và tiêm mao Kiểm tra khả năng di động Vật liệu, hoá chất:  Chuẩn bị ống nghiệm chứa môi trường thạch bán lỏng (0,3-0,6% thạch). Các bước tiến hành:  Dùng que cấy có đầu nhọn cấy vi khuẩn theo kiểu chích sâu vào môi trường thạch bán lỏng.  Đặt ống nghiệm thẳng đứng, ủ ở nhiệt độ thích hợp và quan sát sau 1-3 ngày, có khi lâu hơn. Kết quả: Vi khuẩn mọc lan rộng quanh vết cấy tức là chúng có khả năng di động. Vi khuẩn chỉ mọc theo vết cấy tức là chúng không có khả năng di động Chú ý: với vi khuẩn hiếu khí chỉ quan sát ở phần trên của vết cấy. 1.4. Nhuộm bào tử Có hai phương pháp nhuộm 1.4.1. Nhuộm Lục Malachit (phương pháp Schaeffer-Fulton) Vật liệu, hoá chất:  Dung dịch Lục Malachite (Malachite green) bão hoà (khoảng 7,6%)  Dung dịch Safranin 0,5% (xem nhuộm Gram) Các bước tiến hành:  Làm vết bôi và cố định tế bào như đối với nhuộm Gram.  Nhuộm bằng dung dịch Lục Malachite trong 10 phút, rửa nước.  Nhuộm lại bằng dung dịch Safranine trong 30 giây, rửa nước, thấm khô.  Soi kính: dùng vật kính dầu 100 Kết quả: Bào tử có màu lục, tế bào có màu đỏ. Chú ý: phân biệt bào tử với các hạt dị nhiễm cũng bắt màu lục 1.4.2. Nhuộm Carbolic Fuchsin Vật liệu, hoá chất:  Dung dịch A: 10 ml dung dịch Fuchsin kiềm bão hoà trong etanol (khoảng 10%) 100 ml dung dịch acid carbolic (phenol) 5% (trong nước). Trộn đều với nhau (chuẩn bị trước khi dùng)  Dung dịch B: 100 ml Etanol 95% 3 ml HCl đậm đặc  Dung dịch C: 30 ml dung dịch Xanh metylen (Methylene blue) bão hoà trong etanol (khoảng 2%) 100 ml dung dịch KOH 0,01% trong nước. Trộn đều với nhau, để càng lâu càng tốt. Các bước tiến hành:   Làm vết bôi trên phiến kính, cố định tế bào. Nhỏ dung dịch A lên vết bôi, hơ nóng nhẹ bên dưới để bay hơi, tránh để sôi. Thêm dần dần thuốc nhuộm để không bị khô cạn, giữ trong 5 phút. Đợi nguội, đổ thuốc nhuộm đi.  Dùng dịch B rửa cho đến khi vừa thấy vừa hết màu đỏ, rửa nước.  Nhuộm lại bằng dung dịch B trong 2-3 phút, rửa nước, thấm khô.  Soi kính: dùng vật kính dầu. Kết quả: Bào tử bắt màu đỏ, tế bào bắt màu xanh Hình 1.3. Các bước tiến hành nhuộm Carbolic Fuchsin và ví dụ minh hoạ kết quả. 1.5. Nhuộm vỏ nhầy (Capsule) Có hai phương pháp 1.5.1. Phương pháp nhuộm âm bản Vật liệu, hoá chất:  Mực tàu  Metanol  Dung dịch safranin 0,5% Các bước tiến hành:      Lấy vi khuẩn hoà vào giọt nước trên phiến kính. Nhỏ thêm 1 giọt mực tàu, trộn đều. Dùng cạnh lamen dàn mỏng vết bôi, làm khô trong không khí. Cố định vết bôi bằng cách nhỏ metanol lên vết bôi, giữ trong 1 phút. Thêm dần dần dung dịch Safranin 0,5% lên vết bôi để rửa metanol, sau đó giữ trong 30 giây để nhuộm lại, rửa nước, thấm khô. Soi kính: dùng vật kính dầu 100. Kết quả: Nền vi trường màu đen, tế bào màu đỏ, vỏ nhầy màu hồng. 1.5.2. Phương pháp Đỏ Congo Vật liệu, hoá chất:  Dung dịch Đỏ Congo (Congo red) 2% trong nước  Dung dịch gelatin 0,01-0,1% trong nước  Dung dịch HCl 1%  Hỗn hợp 30 ml dung dịch Xanh metylen bão hoà (khoảng 2%) trộn với 100 ml dung dịch KOH 0,01%. Các bước tiến hành:  Nhỏ 1 giọt dung dịch Đỏ Congo và 1 giọt dung dịch gelatin lên phiến kính sạch.  Lấy vi khuẩn trộn đều với 2 giọt nói trên để làm vết bôi, để khô trong không khí  Nhỏ dung dịch HCl lên để rửa, phiến kính có màu xanh.  Rửa bằng nước để loại bỏ dung dịch HCl.  Nhuộm lại bằng Xanh metylen trong 1 phút, rửa nước, hong khô.  Soi kính: dùng vật kính dầu 100. Kết quả: Nền vi trường màu xanh, tế bào màu đỏ, vỏ nhầy không màu 1.5.3. Phương pháp nhuộm âm bản đơn giản (Hình 1.4):  Nhỏ 1 giọt Nigrosin vào đầu một phiến kính sạch.  Lấy 1 vòng que cấy vi khuẩn trộn với giọt nigrosin.  Lấy một phiến kính khác để nghiêng 450 và kéo giọt nigrosin đã trộn vi khuẩn về phía phải một chút sau đó kéo nhẹ về phía trái để dàn mỏng thành một vết bôi. Để khô tự nhiên (không hơ lửa).  Quan sát dưới kính hiển vi sẽ thấy vỏ nhầy màu sáng nổi lên trên một nền màu đen. Hình 1.4. Nhuộm âm bản dùng Nigrosin và ví dụ minh hoạ kết quả. 1.5.4. Phương pháp dùng Tím kết tinh (Crystal violet) Vật liệu, hoá chất:  Dung dịch Tím kết tinh 1% trong nước  Dung dịch Sulfat đồng CuSO4 20% trong nước Các bước tiến hành:   Nhỏ vài giọt dung dịch tím kết tinh lên phiến kính sạch Lấy vi khuẩn từ ống thạch nghiêng (48 giờ) trộn với dung dịch tím kết tinh, dùng cạnh lam kính dàn đều trên toàn bộ phiến kính để làm vết bôi, giữ trong không khí 5-7 phút để làm khô, không được hơ nóng.  Rửa vết bôi bằng dung dịch sulfat đồng 20%, thấm khô.  Soi kính: dùng vật kính dầu 100. Kết quả:  1.6. Tế bào có màu sẫm, vỏ nhày màu nhạt ở xung quanh. Nhuộm thành tế bào Vật liệu, hoá chất:  Dung dịch acid tannic 5%  Dung dịch Tím kết tinh 0,2% Các bước tiến hành:  Làm vết bôi vi khuẩn  Nhuộm bằng dung dịch acid tannic trong 5 phút, rửa nước.  Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh trong 3-5 phút, rửa nước, thấm khô.  Soi kính: dùng vật kính dầu 100 Kết quả:  1.7. Thành tế bào bắt màu tím, tế bào chất màu tím nhạt. Nhuộm hạt dị nhiễm Vật liệu, hoá chất:  Dung dịch A: Xanh Toluidin (Toluidine blue) Lục malachite Acid acetic (glacial) 0,15 g 0,2 g 1 ml Ethanol 95% Nước cất  2 ml 100 ml Dung dịch B: Iod (I) Iodid kali (IK) Nước cất 2g 3g 300 ml Các bước tiến hành:  Làm vết bôi, cố định vết bôi.  Nhuộm bằng dịch A trong 5 phút, đổ đi  Tráng bằng dịch B, nhuộm thêm trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.  Soi kính: dùng vật kính dầu 100. Kết quả: Các hạt dị nhiễm có màu đen. Các thành phần khác của tế bào bắt màu lục hay lục nhạt 1.8. Nhuộm hạt PHB (Poly-β-hydroxybutyric acid) Vật liệu, hoá chất:  Dung dịch A: Đen Sudan B (Sudan black B) 0,3 g Etanol 70% 100 ml. Trộn đều, lắc mạnh, để qua đêm mới sử dụng.  Dung dịch B: Xylene  Dung dịch C: Dung dịch Safranin 0,5% trong nước. Các bước tiến hành:  Làm vết bôi, cố định vết bôi.  Nhuộm bằng dịch A trong 10 phút, rửa nước, thấm khô.  Dùng dịch B rửa cho đến khi mất màu.  Nhuộm bằng dịch C trong 1-2 phút, rửa nước, thấm khô.  Soi kính: dùng vật kính dầu 100 Kết quả: Hạt PHB bắt màu lam đen. Tế bào và các bộ phận khác có màu đỏ. 1.9. Nhuộm tinh thể protein (ở Bacillus thuringiensis) Vật liệu, hoá chất:  Dung dịch nhuộm: 1 ml dung dịch Fuchsin bão hoà bão hoà (xem nhuộm carbolic fuchsin) trộn với 100 ml dung dịch acid carbolic 5% trong nước. Khi dùng pha loãng 10 lần. Các bước tiến hành:  Làm vết bôi, cố định vết bôi  Nhuộm trong 1 phút, rửa nước, hong khô  Soi kính: dùng vật kính dầu Kết quả: Tinh thể bắt màu đỏ. Bào tử tách rời có vòng màu đỏ 1.10. Nhuộm vi khuẩn kháng acid Vật liệu, hoá chất:  Dung dịch A: Dung dịch Fuchsin kiềm bão hoà trong nước ( 10%) 10 ml Dung dịch acid carbolic 5% trong nước 100 ml Trộn đều 2 dung dịch với nhau.  Dung dịch B: Etanol 95% 100 ml HCl đặc  3 ml Dung dịch C: Dung dịch Xanh metylen bão hoà trong etanol ( 2%) Dung dịch KOH 0,01% trong nước 30 ml 100 ml Các bước tiến hành:   Làm vết bôi, cố định Nhỏ dịch A lên vết bôi, đun nhẹ dưới phiến kính cho bay hơi nhưng không sôi. Thường xuyên bổ sung thêm dịch A để tránh khô vết bôi. Giữ trong 5 phút. Đợi nguội, đổ dịch A đi.  Dùng dịch B rửa cho đến khi thấy vừa mất màu đỏ. Rửa nước kỹ.  Nhuộm bằng dịch C trong 2-3 phút, rửa nước, thấm khô.  Soi kính: dùng vật kính 40 Kết quả: Vi khuẩn kháng acid bắt màu đỏ. Vi khuẩn không kháng acid bắt màu xanh. Hình 1.5. Ví dụ minh hoạ kết quả xác định tính kháng acid của vi khuẩn. 2. ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ: 2.1. Hình thái khuẩn lạc  Lấy 15-20ml môi trường thạch vô trùng, để nguội đến 50 0C rồi đổ vào đĩa Petri (thao tác vô trùng). Nếu có nước ngưng tụ trên nắp hộp cần úp ngược xuống để vào tủ ấm 30-37 0C để làm khô mặt thạch.  Lấy một vòng que cấy gạt 3-4 lần trên mặt thạch ở một góc. Quay đĩa thạch sang hướng khác và ria cấy từ một vạch thành 3-4 đường khác sao cho không trùng với các đường trước. Lặp lại theo một hướng thứ ba để pha loãng hơn nữa phần vi khuẩn dính trên que cấy. Chú ý không nhấc tay lên và không thay đổi hướng của vòng que cấy.  Đặt vào nhiệt độ thích hợp trong 1-2 ngày để chọn ra các khuẩn lạc mọc riêng rẽ.  Tiến hành quan sát các khuẩn lạc này từ các phía (từ trên xuống, từ bên cạnh), chú ý về kích thước, hình dạng khuẩn lạc, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, có núm hay không, độ trong, màu sắc (trên, dưới, có khuếch tán ra môi trường hay không) Hình 2.1. 2.2. Cấy ria tế bào để tách khuẩn lạc đơn và các dạng khuẩn lạc thường gặp. Nhiệt độ sinh trưởng và tính bền nhiệt  Lấy một vòng que cấy sinh khối cấy vào các ống nghiệm có môi trường dinh dưỡng thích hợp (môi trường thạch hoặc dịch thể).  Đặt ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau (3 ống trong một nhiệt độ). Đối với các loài ưa ấm (mesophiles), nhiệt độ sinh trưởng và tính bền nhiệt thường được kiểm tra với thang nhiệt độ 4, 20, 30, 37, 41, 45 và 65 0C. Từ 37 0C trở lên có thể dùng các nồi cách thủy ổn nhiệt.  Quan sát khả năng sinh trưởng của vi khuẩn (tạo sinh khối trên môi trường thạch, hoặc đo OD nếu thí nghiệm được tiến hành trên môi trường dịch thể) Đặc biệt, tính bền nhiệt cần xác định khi phân loại các Liên cầu khuẩn, cách làm như sau: · Cấy 1 giọt dịch nuôi cấy 24 giờ vào ống nghiệm đựng môi trường dịch thể thích hợp. · Giữ ở nồi cách thủy 60 0C trong 30 phút sau đó đặt vào tủ ấm 35-37 0C, nuôi trong 48 giờ. Nếu vi khuẩn phát triển được là có tính bền nhiệt. Dùng chủng vi khuẩn Enterococcus faecalis làm đối chứng dương tính. 2.3. Nhu cầu về O2 và CO2 Căn cứ vào nhu cầu đối với ôxy, vi khuẩn được thành các nhóm hiếu khí, kỵ khí, kỵ khí không bắt buộc và vi hiếu khí. 2.3.1. Nhu cầu đối với ôxy  Vi khuẩn đã hoạt hoá cấy vào môi trường dịch thể thích hợp.  Đặt ở các điều kiện: - không khí chứa 5% CO2 và 10% O2 - không khí bình thường. Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn. 2.3.2. Tính kỵ khí của vi khuẩn sinh bào tử  Chuẩn bị môi trường thạch kỵ khí: Casein thủy phân 20 g NaCl 5g Na-mercaptoacetat Na-formaldehyd sulfoxylate 2g 1g Thạch 15 g Nước cất 1000 ml.  Cấy vi khuẩn theo kiểu chích sâu 1 vòng que cấy (đường kính 1,5 mm) vào môi trường nói trên.  Nuôi ở 30 0C, kiểm tra kết quả sau 3 ngày và 7 ngày. Nếu vi khuẩn mọc ở phía trên là thuộc loại hiếu khí; nếu mọc dọc đường cấy là kỵ khí không bắt buộc; nếu chỉ mọc bên dưới là kỵ khí bắt buộc. 2.4. Khả năng đồng hóa các nguồn carbon Môi trường khoáng cơ bản (g/l):  (NH4)2SO4 2g MgSO4.7H2O 0,2 g NaH2PO4.H2O 0,5 g CaCl2.2H2O 0,1 g K2HPO4 0,5 g Nước cất 1000 ml  Nguồn carbon (đường, polysaccarid, rượu, axit béo, axit amin, axit hữu cơ, hydroxy axit (alcohol axit, dicarboxylic axit…) được khử trùng qua màng lọc.  Bổ sung nguồn carbon vào môi trường khoáng cơ bản (đường và rượu ở nồng độ 0,51%, các loại khác ở nồng độ 0,1-0,2%), chia môi trường vào các ống nghiệm đã tiệt trùng.  Cấy vi khuẩn vào môi trường, sử dụng 3 ống nghiệm đối với mỗi loại nguồn carbon.  Theo dõi sự phát triển để đánh giá khả năng đồng hóa nguồn carbon. Cách khác là chuẩn bị môi trường khoáng cơ sở có thạch và đổ đĩa Petri. Vi khuẩn được cấy dàn đều trên đĩa bằng que gạt. Nguồn carbon ở dạng tinh thể được đưa lên đĩa (khoảng bằng hạt gạo) để cho khuyếch tán dần ra xung quanh. Nếu vi khuẩn đồng hóa được nguồn carbon nào sẽ mọc thành vòng xung quanh chỗ có đặt nguồn carbon đó. Các nguồn carbon thường được dùng trong thí nghiệm: Đường 5C Arabinoza, Riboza, Xyloza, Fucoza, Rhamnoza Đường 6C Glucoza hay Dextroza, Mannoza, Sorboza, Fructoza hay Levuloza, Galactoza Đường kép Saccharoza hay Sucroza-Đường kính, Maltoza, Sorboza, Lactoza, Trehaloza, Cellobioza, Melibioza Đường tam Raffinoza, Melizitoza Đường đa Tinh bột (Starch), Dextrin, Inulin, Glycogen Rượu bậc 3 Glycerol Rượu bậc 4 Erythritol Rượu bậc 5 Adonitol, Arabitol, Xylitol Rượu bậc 6 Mannitol, Sorbitol, Dulcitol Rượu bậc 6 mạch vòng Glucoside 2.5. Inozitol Salicin, Coniferrin, Aesculin, Arbutyl, Amygdalin, alpha-Methylglucosid Khả năng đồng hóa các nguồn nitơ  Môi trường cơ sở: KH2PO4 1,36 g CaCl2 NaHPO4. 5 ml 2,13 g MgSO4.7H2O 0,2 g FeSO4.7H2O 0,5 ml Glucoza 10 g Nước cất 1000 ml Glucoza có thể được thay thế bằng nguồn carbon thích hợp khác như Citrat, Acetat, Mannit… với nồng độ 0,2-0,5%. Các nguồn nitơ khác nhau (muối ammon, muối nitơrat) được đưa vào môi trường với nồng độ 0,05-0,1%. Đối chứng là môi trường hoàn toàn không bổ sung nguồn nitơ. Chỉnh pH tới 7,0-7,2. Chia môi trường vào các ống nghiệm (4-5 ml/ ống), khử trùng ở 112 0C trong 20-30 phút.   2.6. Cấy vi khuẩn đã hoạt hoá 18-24 giờ (3 ống cho mỗi loại nguồn nitơ). Đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 3 ngày và 7 ngày. So sánh sự phát triển với đối chứng (đo độ đục của dịch tế bào) để xác định khả năng đồng hóa nguồn nitơ. Khả năng sinh sắc tố huỳnh quang  Môi trường làm ống thạch nghiêng: Pepton 20 g Glyxerin 10 g K2HPO4 1,5 g MgSO4.7H2O 1,5 g Thạch 15 g Nước cất 1000 ml pH = 7,2. Khử trùng ở 121 0C trong 20 phút, đặt thạch nghiêng.  Cấy vi khuẩn đã hoạt hóa 24 giờ lên mặt thạch, đưa vào tủ ấm và theo dõi sau 1, 3, 5 ngày.  Quan sát ống nghiệm dưới đèn tử ngoại xem có sản sinh sắc tố huỳnh quang hay không? 2.7. Tính mẫn cảm đối với chất kháng khuẩn  Chuẩn bị môi trường thạch đĩa thích ứng với từng loại vi khuẩn.  Cấy gạt vi khuẩn lên mặt thạch đĩa (có thể trộn vi khuẩn vào môi trường thạch đã làm nguội tới 50 0C rồi đổ đĩa).  Đặt lên mặt thạch các khoanh giấy (tự chế hoặc mua sẵn) tẩm chất kháng khuẩn ở các nồng độ khác nhau.   Nuôi trong tủ ấm 30 0C trong 24-48 giờ. Quan sát các vòng vô khuẩn tạo thành xung quanh các khoanh giấy chứa chất kháng khuẩn. Vòng vô khuẩn càng lớn tức là vi khuẩn càng mẫn cảm. Hình 2.2. 2.8. Vòng vô khuẩn tạo thành quanh các khoanh giấy thấm chất kháng khuẩn. Đồng hóa Malonat  Môi trường dịch thể: Cao men (NH4)2SO4 K2HPO4 1g 2g 0,6 g KH2PO4 0,4 g Natri malonat 3g Bromophenol blue (BPB) Nước cất 0,025 cg 1000ml pH= 7,0-7,4  Chia môi trường vào ống nghiệm, khử trùng ở 121 0C trong 15 phút. Đối chứng là môi trường không có Natri-malonat.  Cấy vi khuẩn đã hoạt hóa, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 1-2 ngày.  Quan sát sự đổi mầu của môi trường: nếu chuyển màu từ lục sang lam là có đồng hóa malonat (dương tính), nếu không là âm tính. Hình 2.3. Sự đổi mầu của môi trường khi vi khuẩn đồng hoá malonat. 2.9. Xét nghiệm đồng hóa Citrat Mục đích: phân biệt các nhóm vi khuẩn đường ruột dựa trên khả năng đồng hoá citrat.  Môi trường Simmons: NaCl 5g MgSO4.7H2O 0,2 g NH4H2PO4 1g K2HPO4.3H2O 1g Natri xitrat 2g BPB 1% trong nước 10 ml Thạch (đã rửa nước) 12 g Nước cất 990 ml. Đun tan thạch, chỉnh pH đến 7,0, thêm chỉ thị màu BPB và phân vào ống nghiệm để làm thạch nghiêng. Khử trùng ở 121 0C trong 15 phút.    Cấy vi khuẩn vào ống thạch, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 3-7 ngày. Môi trường biến màu từ lam sang đỏ đào tức là vi khuẩn có khả năng đồng hóa citrat (dương tính). Với các loài Bacillus cần sử dụng môi trường sau: NaCl 1g MgSO4.7H2O 0,2 g NH4H2PO4 0,5 g Natri xitrat 2g Nước cất 1000 ml Đỏ phenol (Phenol red) 0,04% 20 ml. 2.10. Nhu cầu muối và tính chịu muối  Chuẩn bị môi trường dịch thể thích hợp đối với từng loài vi khuẩn.  Bổ sung NaCl ở các nồng độ 2, 5, 7, 10%, môi trường cần trong suốt.  Cấy vi khuẩn đã hoạt hóa, ủ trong 3-7 ngày.  Theo dõi mức độ sinh trưởng của vi khuẩn (môi trường không cấy vi khuẩn làm đối chứng). 2.11.  Khả năng đồng hóa Tartrat Môi trường dịch thể để kiểm tra: Pepton 10 g NaCl 5g Nước cất 1000 ml BPB (0,2%) 12,5 ml Kali tartrat 10 g Chỉnh pH = 7,4. Phân môi trường vào ống nghiệm, khử trùng ở 115 0C trong 20 phút, nên dùng ngay. Nếu để môi trường quá 14 ngày thì cần khử trùng lại bằng đun cách thủy 10 phút.  Cấy vi khuẩn vào môi trường, hàng ngày theo dõi sự đổi màu.  Sau 14 ngày thêm một lượng dung dịch chì acetat bão hòa trung tính bằng thể tích môi trường (vol/vol). Đối chứng là môi trường không cấy vi khuẩn.  Nếu có chuyển sang màu lục vàng và có ít chì acetat kết tủa là có khả năng đồng hóa tartrat (dương tính). Nếu màu vàng hay màu lục và có nhiều chì acetat kết tủa là xét nghiệm âm tính.  Phản ứng này dùng để phân biệt Salmonella zava (dương tính) và Salmonella paratyphi B (âm tính). 2.12. Khả năng sinh trưởng với KCN KCN có tác dụng ức chế Escherichia coli nhưng không ức chế Citrobacter freundi, vì thế thường được dùng để phân biệt 2 loài này.  Môi trường cơ sở: Pepton 3g NaCl 5g KH2PO4 0,22 g K2HPO4 5,64 g Nước cất 1000 ml. pH = 7,6. Khử trùng ở 115 0C trong 20 phút. Để môi trường vào tủ lạnh cho nguội đến 4 0C, thêm 15ml dung dịch KCN 0,5%, phân vào mỗi ống nghiệm 1ml (thao tác vô trùng); có thể bảo quản được trong 2 tuần. Môi trường đối chứng không thêm dung dịch KCN.  Cấy vi khuẩn từ mới hoạt hoá (24 giờ) vào các môi trường đã chuẩn bị trên, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 4 ngày và quan sát sự chuyển màu của môi trường.  Nếu môi trường chuyển màu đỏ là sinh trưởng dương tính (Citrobacter freundii), nếu môi trường vẫn không màu là sinh trưởng âm tính (Escherichia coli). 3. CÁC ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA: 3.1. Xét nghiệm oxidaza Mục đích: phân biệt các nhóm vi khuản dựa trên hoạt tính cytochrom oxidaza  Pha dung dịch Tetramethyl-p-phenylen diamin dihydrochlorid (TPPDD) 1% trong nước, bảo quản trong lọ màu tối ở 4 C, sử dụng trong 2 tuần.  Đặt một miếng giấy lọc trong nắp hộp Petri sạch, nhỏ dung dịch TPPDD 1% lên trên miếng giấy lọc sao cho vừa đủ ẩm, không để quá ướt.  Dùng que cấy có đầu que làm bằng sợi platin hay dùng đũa thủy tinh (không dùng đầu que cấy bằng sợi kim loại sắt, niken...) lấy một ít vi khuẩn đã hoạt hoá (18-24 giờ) bôi lên miếng giấy lọc.  Sau 10 giây nếu vi khuẩn chuyển sang màu hồng tức là có oxydaza dương tính; nếu sau 60 giây mới chuyển màu là oxydaza âm tính.  3.2. Chú ý: nếu dung dịch đã tự chuyển sang màu hồng rồi thì không được sử dụng. Nếu giấy lọc quá ướt sẽ cản trở khuẩn lạc tiếp xúc với không khí nên chuyển màu chậm, tạo nên âm tính giả. Xét nghiệm catalaza Mục đích: kiểm tra khả năng phân huỷ H2O2 của vi sinh vật nhờ sản sinh ra enzyme catalaza.     Hình 3.1. 3.3. Chuẩn bị dung dịch H2O2 nồng độ 3-10%, nhỏ một giọt lên phiến kính. Dùng đầu que cấy platin lấy một ít vi khuẩn mới hoạt hoá (24 giờ) trộn vào giọt H 2O2 trên phiến kính. Nếu thấy sủi bọt là dương tính, không sủi bọt là âm tính. Có thể nhỏ trực tiếp dung dịch H 2O2 lên khuẩn lạc trên thạch đĩa cũng cho kết quả tương tự. Phản ứng sủi bọt khi tiếp xúc với dung dịch H 2O2 của vi khuẩn có catalaza dương tính. Khả năng lên men/ôxy hóa glucoza Có thể dùng một trong hai môi trường sau để làm thí nghiệm  Môi trường I: Pepton 2g NaCl 5g K2HPO4 0,2 g Glucoza 10 g Thạch 6g Dung dịch BTB 1% thành dung dịch 1%) Nước cất 3 ml (pha trong một ít cồn 95%, sau đó mới thêm nước để 1000 ml. pH = 7,0 - 7,2. Phân môi trường vào các ống nghiệm (4-5 ml), khử trùng ở 115 0C trong 20 phút.  Môi trường II: NH4H2PO4 0,5 g K2HPO4 0,5 g Cao men 0,5 g Glucoza 10 g Thạch 5-6 g Dung dịch BTB 1% Nước cất 3 ml (pha như trên) 1000 ml pH = 7,0 - 7,2. Phân môi trường vào ống nghiệm và khử trùng như trên.   Lấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 h) cấy chích sâu vào môi trường bằng que cấy thẳng (mỗi chủng vi khuẩn cấy vào 4 ống). Bịt kín 2 ống nút bông bằng vaselin-paraffin (lấy vaselin làm chảy ra, thêm 1/3 dầu paraffin) để cách ly với không khí. Ngoài ra lấy thêm 2 ống không cấy vi khuẩn làm đối chứng. Theo dõi kết quả sau 1,2,3,7 và 14 ngày. Kết quả: - Nếu chỉ có ống không bịt kín sinh axit (chuyển màu vàng) tức là vi khuẩn thuộc dạng ôxy hóa. - Nếu cả ống không bịt và ống bịt kín đều sinh axit (chuyển màu vàng) tức là vi khuẩn thuộc dạng lên men. 3.4. Khả năng lên men đường, rượu  Môi trường: Cao thịt 3g Pepton 10 g NaCl 5g Chất chỉ thị màu Andrade* 10 ml (hay dung dịch Xanh bromophenol 0,2%) Nước cất thêm đến 1000 ml  Bổ sung đường với nồng độ 0,5%. Phân môi trường vào các ống nghiệm, mỗi ống 1ml.  Đặt vào mỗi ống nghiệm 1 ống nhỏ (ống Durham) lộn ngược đầu để hứng khí CO 2 sinh ra nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường. Khử trùng trong 15 phút ở 121 0C. Đường arabinoza, xyloza, và các đường kép cần khử trùng riêng bằng màng lọc rồi mới bổ sung vào môi trường. * Cách pha chất chỉ thị màu Andrade: Fuchsin axit NaOH 1M Nước cất 0,5 g 16 ml 100 ml Nếu dung dịch có màu hồng, dùng NaOH 0,1 M (1-2 ml) để trung hòa cho đến khi mất màu. Xanh bromophenol (BPB): 2 g BPB, bổ sung dần 5 ml NaOH 0,1M, nghiền trong cối sứ, hòa với nước cất cho đủ 100 ml.  Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá vào các ống nghiệm, đặt ở 36 0C, theo dõi hiện tượng sinh axit sau 1-3 ngày. Có trường hợp cần dùng paraffin để bịt kín nút bông và theo dõi trong 14-30 ngày  Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường (sinh axit) thì chất chỉ thị Andrade sẽ chuyển màu đỏ, chất chỉ thị BPB sẽ chuyển màu vàng lục. Có thể làm cách khác như sau:   Với vi khuẩn nói chung dùng môi trường I (xem mục 3.3), thay glucoza các đường khác hay rượu (nồng độ 1). Với vi khuẩn sinh bào tử dùng môi trường sau: (NH4)2HPO4 KCl 1g 0,2 g MgSO4 0,2 g Cao men 0,2 g Thạch 5-6 g Đường hay rượu 10 g Nước cất 1000 ml Dung dịch BTB 0,04% 15 ml pH = 7,0-7,2. Phân môi trường vào các ống nghiệm (4-5 ml), khử trùng ở 112 0C trong 30 phút.  Với vi khuẩn lactic dùng môi trường sau: Pepton 5g Cao thịt 5g Cao men 5g Tween 80 0,5 ml Thạch 5-6 g Nước cất (hay nước máy) 1000 ml Dung dịch BTB 1,6% 1,4 ml pH = 6,8-7,0. Phân môi trường vào ống nghiệm, khử trùng tại 112 0C trong 30 phút.  Lấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ) cấy trích sâu vào môi trường thạch, đặt ở nhiệt độ thích hợp và quan sát sau 1,3,5 ngày.  Nếu chỉ thị màu biến vàng là vi khuẩn có khả năng lên men sinh axit (phản ứng dương tính); nếu vẫn giữ màu lam là phản ứng âm tính. 3.5. Phản ứng M.R. (Đỏ Methyl - Methyl Red)  Môi trường: Pepton 5g Glucoza 5g K2HPO4 hoặc NaCl 5g Nước cất 1000 ml. pH = 7,0 - 7,2. Phân môi trường vào ống nghiệm (4-5 ml), khử trùng ở 115 0C trong 30 phút.  Thuốc thử: Đỏ Methyl 0,1 g Etanol 95% 300 ml Nước cất 200 ml.  Cấy vi khuẩn vào môi trường (lặp lại 2 lần), đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 2-6 ngày (nếu kết quả âm tính cần kéo dài thêm thời gian). Với Vi khuẩn đường ruột thuộc họ Enterobacteriaceae, đặt ống nuôi cấy ở 37 0C và kiểm tra sau 4 ngày.  Nhỏ 1 giọt thuốc thử vào dịch nuôi cấy, nếu chuyển màu đỏ là phản ứng dương tính, màu vàng là âm tính (màu đỏ ở pH 4,4; màu vàng ở pH 6,0). Hình 3.2. Chất chỉ thị đỏ methyl chuyển màu khi tiếp xúc với dịch nuôi cấy vi khuẩn lên men đường. 3.6. Phản ứng V.P. (Voges-Proskauer)  Môi trường: xem phần 3.5.  Thuốc thử: Creatin NaOH   0,3% (hoặc để nguyên dạng tinh thể) 40% Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 2-6 ngày. Bổ sung NaOH 40 (bằng thể tích dịch nuôi cấy), sau đó nhỏ một ít dung dịch creatin (hoặc thêm một ít tinh thể), đợi khoảng 10 phút (có khi lâu hơn). Nếu dịch thể chuyển màu đỏ là phản ứng dương tính. Cách khác:  Môi trường Clark-Lubs: Pepton 3g K2HPO4 5g Glucoza 5g pH = 7,5.  Phản ứng V.P: nhỏ 5 giọt dung dịch alpha naphtol 6% (trong cồn 90%, giữ ở 4 C trước khi dùng) và 5 giọt NaOH 16% (trong nước), lắc nhẹ. Nếu dịch thể chuyển sang màu đỏ nâu là phản ứng dương tính, màu vàng nhạt là âm tính.  Phản ứng M.R: nhỏ 2-3 giọt dung dịch Đỏ methyl 0,5% (trong cồn 60%), lắc nhẹ. Nếu dịch thể chuyển màu đỏ là phản ứng dương tính, màu vàng nhạt hay không màu là âm tính. Hình 3.3. Ví dụ minh hoạ kết quả phản ứng V.P. và M.R. 3.7. Phản ứng galactopyranosidase)  ONPG-aza (O-nitrophenyl-β-D- Môi trường: ONPG 0,6 g Đệm phosphat 0,01M pH 7,5 100 ml Dung dịch pepton 1% (pH 7,5) 300 ml. (Hoà 0,6 g ONPG trong 100 ml dung dịch đệm, khử trùng bằng màng lọc, sau đó trộn với 300 ml dung dịch pepton đã khử trùng). Bằng thao tác vô khuẩn phân môi trường vào các ống nghiệm nhỏ, bảo quản ở 4 C trong vòng 1 năm.  Cắt những khoanh giấy lọc, khử trùng 112 C, 30 phút.  Nhỏ vào mỗi khoanh giấy lọc một giọt dung dịch sau: ONPG 0,06 g Na2HPO4.2H2O 0,017 g Nước cất 10 ml Làm khô ở 37 0C trong 24 giờ, bảo quản trong các ống nghiệm có nút xoáy ở nhiệt độ phòng.  Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (1 vòng que cấy) vào môi trường đã chuẩn bị như trên, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 24 giờ.  Ly tâm dịch nuôi cấy thu tế bào, làm dịch huyền phù đậm đặc trong 0,5 ml nước muối sinh lý.  Đưa khoanh giấy ONPG vào dịch huyền phù, giữ ở 35-37 0C trong 24 giờ. Quan sát kết quả: màu vàng là phản ứng dương tính (Escherichia coli); không màu là âm tính (Salmonella paratyphi B). Proteus mirabilis- ONPG (ống thứ 8) âm tính Serratia marcescens- ONPG (ống thứ 8) dương tính Hình 3.4. Ví dụ minh hoạ kết quả phản ứng OPNG-aza 3.8. Khả năng thủy phân tinh bột  Môi trường: Bổ sung tinh bột tan (0,2%) vào môi trường nước thịt pepton, khử trùng ở 121 0C trong 20 phút, đổ đĩa Petri.  Lấy vi khuẩn mới hoạt hoá cấy vạch hay cấy chấm lên đĩa thạch. Sau 2-5 ngày nhỏ thuốc thử Lugol (xem phần nhuộm Gram) lên vết cấy để quan sát khả năng phân giải tinh bột. Nếu thuốc thử Lugol không bắt màu quanh vết cấy tức là vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột. Hình 3.5. 3.9. Phản ứng với dịch Lugol kiểm tra khả năng phân giải tinh bột của vi khuẩn. Khả năng tạo tinh thể Dextrin  Môi trường: hoà 50 g bột gạo vào 200 ml nước, quấy kỹ, thêm 20 g CaCO 3, sau đó bổ sung dần dần 750 ml nước sôi, đồng thời quấy đều rồi đun sôi 10 phút. Phân môi trường vào các ống nghiệm (15 ml/ống), khử trùng ở 121 0C trong 30 phút.  Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ) vào môi trường trên, đặt ở 30 0C trong 5-10 ngày.  Bổ sung 1ml dung dịch tinh bột 3%, giữ ở 40 0C trong 15 phút.  Lấy 3 giọt dịch trong phía trên hoà với 1 giọt dung dịch Lugol và dàn lên phiến kính, làm khô trong không khí và quan sát dưới kính hiển vi.  Nếu được sản sinh ra, những tinh thể dextrin hình lục giác bắt màu lam có thể quan sát được ở sát mép vết bôi. 3.10.  Khả năng phân giải celluloza Môi trường khoáng: NH4NO3 1g K2HPO4 0,5 g KH2PO4 0,5 g MgSO4. 7H2O 0,5 g NaCl 1g CaCl2 0,1 g FeCl3 0,02 g Cao men 0,05 g Nước cất 1000 ml pH = 7,0- 7,2. Phân môi trường vào ống nghiệm, khử trùng ở 121 0C trong 20 phút.  Môi trường Pepton: Pepton 5g NaCl 5g Nước máy 1000 ml pH = 7,0-7,2 Phân môi trường vào ống nghiệm, khử trùng ở 121 0C trong 20 phút.  Cho vào ống nghiệm một băng giấy lọc dài 5-7 cm (với vi khuẩn hiếu khí để một phần băng giấy lọc nhô lên khỏi môi trường; với vi khuẩn kỵ khí thỉ để băng giấy lọc ngập trong môi trường).  Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá, đặt ở nhiệt độ thích hợp, quan sát ảnh hưởng của vi khuẩn tới băng giấy lọc sau 1-4 tuần. Nếu vi khuẩn phát triển và làm nát giấy lọc tức là chúng có khả năng phân giải celluloza (phản ứng dương tính); âm tính là không làm biến đổi giấy lọc. Cách khác:  Đổ vào đĩa Petri một lớp thạch 2% (15 ml thạch cho một đĩa  9 cm).  Bổ sung bột celluloza (0,8%) và thạch (1,5%) vào môi trường ghi ở trên, đổ 5 ml lên trên lớp thạch 2% đã chuẩn bị trong đĩa Petri.  Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá thành điểm trên môi trường, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 1-4 tuần và quan sát vòng phân giải celluloza được tạo ra quanh vết cấy. 3.11. Khả năng thủy phân pectin  Môi trường: Cao men 5g CaCl2.2H2O 0,5 g Thạch 8g Na-polypectat 10 g Nước cất 1000 ml NaOH 1N Dung dịch BTB 0,2% 9 ml 12,5 ml. Để hoà tan Na-polypectat và các thành phần khác cần khuấy mạnh và làm nóng môi trường trong nồi cách thủy. Khử trùng ở 121 0C không quá 5 phút rồi đổ đĩa Petri.  Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá thành 8 chấm trên thạch đĩa, đặt ở nhiệt độ thích hợp 3 ngày rồi quan sát. Nếu quanh vết cấy có vệt lõm xuống là dương tính (Erwinia carotova); không có vệt lõm xuống là âm tính (Erwinia herbicola). 3.12.  Khả năng thủy phân Esculin Môi trường: Bổ sung Esculin (0,1%) và citrat sắt (0,05%) vào môi trường nước thịt pepton. Phân môi trường vào các ống nghiệm để làm thạch nghiêng. Khử trùng ở 121 0C trong 20 phút.  Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ), đặt ở nhiệt độ thích hợp sau 3,7 và 14 ngày rồi lấy ra để quan sát.  Kết quả: xuất hiện sắc tố màu đen nâu là phản ứng dương tính, không có là âm tính 3.13.  Khả năng tạo Dextran và Levan Môi trường Casein thủy phân 15 g Pepton 5g Đường kính 50 g K2HPO4 4g Thạch 10 g Nước cất 1000 ml Dung dịch Xanh Trypan (Tripan blue) 1% trong nước Dung dịch Tím kết tinh 1% trong nước 7,5 ml 0,1 ml pH 7,0 Khử trùng ở 115 0C trong 20 phút. Để nguội đến 50 0C, thêm 1ml dung dịch Kali-tellurit 1% (đã khử trùng bằng màng lọc) rồi đổ đĩa Petri.  Cấy ria để tạo khuẩn lạc đơn. Đặt ở 37 0C trong 24 giờ, sau đó giữ thêm ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.  Vi khuẩn sinh dextran sẽ có khuẩn lạc nhỏ, màu lam tối, bề mặt nhầy và mọc lõm vào thạch (loài Streptococcus sanguis). Vi khuẩn sinh levutan có khuẩn lạc nhầy màu phấn hồng (Streptococcus salivarius). Nếu không sinh dextran và levan thì vi khuẩn có màu lam nhạt hoặc tối, kích thước nhỏ, dễ hóa sữa (Streptococcus mitis). 3.14.  Xác định 3-Ketolactoza Môi trường: Lactoza 10 g Cao men 1g Thạch 20 g Nước cất 1000 ml pH = 7,0-7,2 Khử trùng ở 115 0C trong 20-30 phút, đổ đĩa Petri.   Lấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ) cấy điểm lên thạch đĩa, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 2 ngày để tạo khuẩn lạc rõ rệt. Pha thuốc thử Benedict: CuSO4.5H2O 17,3 g Na2CO3 (khan) 100 g Na-Citrat 173 g Nước cất thêm tới 1000 ml Cách pha: hoà Na2CO3 và Na-Citrat trong 600 ml nước cất, lọc trong, sau đó thêm nước tới 850ml. Hoà tan CuSO4 trong 100 ml nước, bổ sung nước cho tới 150 ml. Cuối cùng trộn dung dịch CuSO4 vào dung dịch đầu, vừa đổ vừa khuấy.  Nhỏ thuốc thử Benedict lên khuẩn lạc trên mặt đĩa thạch, để từ 30 phút trở lên ở nhiệt độ phòng.  Kết quả: nếu quanh khuẩn lạc xuất hiện những kết tủa màu nâu thì là phản ứng dương tính, nếu không thì là âm tính. 3.15.  Khả năng khử Nitrat Môi trường: Nước thịt pepton 1000 ml KNO3 1g pH = 7,0-7,6 Phân môi trường vào các ống nghiệm (4-5 ml/ống), khử trùng ở 121 0C trong 15-20 phút.  Chuẩn bị thuốc thử Griess: Dung dịch A: Acid sulfanilic Acid acetic loãng (khoảng 10%) Dung dịch B: Alpha Naphtylamin Nước cất Acid acetic loãng (khoảng 10%) 0,5 g 150 ml. 0,1 g 20 ml 150 ml.  Chuẩn bị thuốc thử Diphenylamin: 0,5 g Diphenylamin hòa vào 100 ml H 2SO4 đặc, thêm 20ml nước cất.  Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá vào môi trường (mỗi chủng cấy 2 ống), đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 1,3,5 ngày. Chọn 2 ống không cấy vi khuẩn để làm đối chứng.  Lấy ống nghiệm sạch và bổ sung lần lượt các dung dịch như sau: Dịch nuôi cấy vi khuẩn (hoặc môi trường ở ống đối chứng) 1 giọt dung dịch A 1 giọt dung dịch B  Kết quả: - Nếu dịch nuôi cấy chuyển màu (đỏ, hồng, da cam hay nâu) là biểu thị có nitơrit, tức là vi khuẩn có khả năng khử Nitrat. - Nếu dịch nuôi cấy không chuyển màu, thêm 1-2 giọt thuốc thử Diphenylamin để kiểm tra sự có mặt của Nitrat (chuyển màu xanh lam là có Nitrat chứng tỏ vi khuẩn không khử Nitrat; không chuyển màu tức là Nitrat đã được khử hết và nitơrit được khử tiếp tục thành các chất khác như N2).  Chú ý: phản ứng khử Nitrat thực hiện trong điều kiện kỵ khí, vì vậy không được phân vào ống nghiệm quá ít môi trường. Đối với các vi khuẩn khác nhau nitơrit có thể là sản phẩm cuối cùng của quá trình khử Nitrat, nhưng cũngcó thể chỉ là sản phẩm trung gian. Ngoài ra, tốc độ khử của các loài cũng khác nhau, vì thế cần theo dõi thường xuyên màu sắc của môi trường. Trong mọi trường hợp cần phải làm thêm phản ứng với chất chỉ thị diphenylamin. 3.16.  Khả năng khử Nitrit Môi trường: Peptone 5g NaNO2 1g Nước cất 1000 ml pH = 7,3-7,4 Phân môi trường vào các ống nghiệm, khử trùng ở 121 0C trong 15 phút.  Chuẩn bị thuốc thử Griess: giống như phần khử Nitrat.  Cấy vi khuẩn, đặt ở 30 0C trong 1,3,7 ngày rồi làm phản ứng xác định.  Nhỏ vào dịch nuôi cấy 1 giọt dung dịch A và 1 giọt dung dịch B (xem phần khử Nitrat), lắc nhẹ. Nếu mất màu đỏ và sinh ra NH 3 là kết quả dương tính (Alcaligenes odorans); nếu vẫn giữ màu đỏ là phản ứng âm tính, không khử nitơrit (Acinetobacter calcoaceticus). 3.17.  Khả năng phản nitrat hóa (Denitrification) Môi trường: Nước thịt pepton KNO3 100 ml 1g pH = 7,2-7,4 Phân môi trường vào các ống nghiệm (4-5 ml), khử trùng ở 121 0C trong 30 phút.  Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá. Dùng vaselin bịt kín nút để ngăn ôxy, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 1-7 ngày và quan sát sự phát triển của vi khuẩn (tăng độ đục của dịch nuôi cấy, sinh khí NH3). Vi khuẩn có phát triển là phản ứng dương tính, không phát triển là âm tính. 3.18.  Khả năng sinh amonia Môi trường: Pepton 5g Nước cất 1000 ml pH= 7,2 Phân môi trường vào các ống nghiệm, khử trùng ở 121 0C trong 15-20 phút.  Chuẩn bị thuốc thử Nessler: Hoà tan 20 g IK trong 50 ml nước; bổ sung I 2Hg cho đến khi bão hòa (khoảng 32g), sau đó thêm 460 ml nước. Cuối cùng bổ sung 134 g KOH. Bảo quản trong lọ tối ở nhiệt độ phòng.   3.19. Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ), đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 1,3,5 ngày. Lấy vào ống nghiệm sạch một ít dịch nuôi cấy, nhỏ vài giọt thuốc thử Nessler. Nếu xuất hiện kết tủa màu vàng nâu là phản ứng dương tính. Xét nghiệm Ureaza Mục đích: kiểm tra khả năng phân huỷ urê nhờ enzyme ureaza  Môi trường: Pepton 1g NaCl 5g Glucoza 1g KH2PO4 2g Dung dịch Đỏ phenol 0,2% trong nước 6 ml Thạch 20 g Nước cất 1000 ml Khử trùng xong chỉnh pH đến 6,8-6,9, môi trường có màu vàng hơi ánh đỏ là được. Phân môi trường vào các ống nghiệm để làm thạch nghiêng. Khử trủng lại ở 115 0C trong 30 phút.  Chuẩn bị dung dịch Urê 20%, khử trùng bằng màng lọc, bổ sung vào các ống nghiệm khi đã nguội đến 50-55 0C (đạt nồng độ Urê 2%), đặt thạch nghiêng.  Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá, đặt ở nhiệt độ thích hợp, sau 2-4 giờ lấy ra quan sát. Kết quả âm tính cần tiếp tục quan sát sau 4 ngày.  Kết quả: môi trường chuyển màu đỏ cánh đào là phản ứng dương tính, màu sắc không thay đổi là âm tính.  Chú ý: cần làm đối chứng âm tính (không bổ sung Urê), nhất là khi xác định các loài Pseudomonas, và đối chứng dương tính (so sánh với 1 chủng đã biết có hoạt tính ureaza). Làm cách khác:  Cấy vi khuẩn vào môi trường thạch nghiêng nói trên và xác định hoạt tính ureaza sau 3 ngày và 7 ngày.  Lấy vi khuẩn từ thạch nghiêng làm dịch huyền phù đậm đặc trong ống nghiệm sạch.  Nhỏ 1 giọt Đỏ phenol vào dịch huyền phù, chỉnh pH đến 7 (Đỏ phenol chuyển từ vàng sang da cam).  Chia dịch huyền phù vào 2 ống nghiệm sạch. Trong ống 1 thêm vài tinh thể Urê (khoảng 0,05-0,1 g), ống thứ 2 giữ nguyên để làm đối chứng. Sau vài phút nếu dịch trong ống 1 (có Urê) chuyển sang kiềm (Đỏ phenol chuyển màu đỏ), biểu thị vi khuẩn có hoạt tính Ureaza; nếu không thì là âm tính. 3.20.  Xét nghiệm sinh Indol Môi trường: Dung dịch Pepton 1% trong nước pH đến 7,2- 7,6. Phân môi trường vào các ống nghiệm (1/3-1/4 thể tích ống), khử trùng ở 115 0C trong 30 phút.  Chuẩn bị thuốc thử: Para-dimethyl-amino-benzaldehyde 8g Etanol 95% 760 ml HCl đặc 160 ml  Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ), đặt ở nhiệt độ thích hợp và làm phép thử tại các thời điểm 1, 2, 4, 7 ngày.  Nhỏ thuốc thử theo mép ống nghiệm (tạo thành lớp dày 3-5 mm). Giữa hai lớp thuốc thử và dịch nuôi cấy nếu có màu đỏ là phản ứng dương tính. Nếu màu sắc không rõ rệt thì thêm 4-5 giọt eter vào dịch nuôi cấy, lắc nhẹ làm cho eter khuếch tán vào lớp dịch, để yên một lát khi eter nổi lên bề mặt thì lại thêm thuốc thử nói trên. Nếu trong môi trường có indol thì sẽ xuất hiện màu đỏ trong lớp eter. Hình 3.5. 3.21. Thuốc thử chuyển màu đỏ khi trong dịch nuôi cấy có indol. Xét nghiệm Phenylalanin desaminaza (kiểm tra khả năng chuyển hoá nhóm amin (NH2) trong acid amin)  Môi trường: Cao men 3g Na2HPO4 1g DL-Phenylalanin (hoặc L-Phenylalanin) 1g NaCl 5g Thạch 12 g Nước cất 1000 ml pH = 7,0 Phân môi trường vào các ống nghiệm, khử trùng ở 121 0C trong 10 phút, đặt thạch nghiêng.  Thuốc thử:  Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá, đặt ở 37 0C, làm phép thử sau 4 giờ hoặc 8-24 giờ.  dung dịch FeCl3 10% (W/V) Nhỏ 4-5 giọt thuốc thử lên bề mặt thạch nghiêng có vi khuẩn phát triển, nếu xuất hiện màu lục là phản ứng dương tính (do sản sinh ra acid Phenylpyruvic), nếu không đổi màu thì là phản ứng âm tính. Hình 3.6. Thí nghiệm kiểm tra phenylalanin desaminaza. 3.22. Tryptophan desaminaza Có hai cách kiểm tra: Cách thứ nhất: xác định đồng thời Tryptophan desaminaza, Ureaza và khả năng sinh Indol.  Môi trường: L-Tryptophan 3g KH2PO4 1g K2HPO4 1g NaCl 5g Etanol 95% 10 ml Nước cất 900 ml. Thêm Đỏ phenol (khoảng 25- 30mg) pH = 6,8-6,9 Phân môi trường vào các bình tam giác, khử trùng ở 121 0C trong 20 phút.   Hoà 20 g Urê vào 100ml nước, khử trùng bằng màng lọc, bổ sung vào môi trường đã chuẩn bị ở trên (thao tác vô trùng). Phân môi trường vào các ống nghiệm vô khuẩn (3-4 ml). Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ), nuôi ở nhiệt độ thích hợp trong 24 giờ.  Lấy ra 2-4 giọt dịch nuôi cấy, thêm 1 giọt dung dịch FeCl 3 (khoảng 33%). Nếu hiện màu nâu đỏ là phản ứng Tryptophan desaminaza dương tính, không hiện màu là phản ứng âm tính. Dùng vi khuẩn Proteus làm đối chứng dương tính.  Nếu môi trường sau khi nuôi cấy vi khuẩn chuyển từ màu vàng sang đỏ là biểu hiện có hoạt tính Ureaza. Dùng thuốc thử para-dimethylaminobenzaldehyd để kiểm tra sự hình thành indol. Nếu không định kiểm tra ureaza thì không cần bổ sung Đỏ phenol và Urê vào môi trường. Cách 2 thứ hai:  Chuẩn bị hoá chất: L-Tryptophan 0,2-0,5% Nước muối sinh lý hoặc dung dịch đệm phosphat pH 6,8 Dịch A: 50 ml KH2PO4 0,2 M (27,2g/L) Dịch B: 23,6 ml Na2CO3 0,2 M (8g/L) Trộn dịch A và B với nhau FeCl3 33%  Cấy vi khuẩn vào môi trường thạch nghiêng nước thịt pepton, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 24 giờ.  Lấy 4 ống nghiệm sạch, thêm vào mổi ống 4 giọt dung dịch L- Tryptophan 0,2-0,5% và 4 giọt nước muối sinh lý (hay dung dịch đệm phosphat pH 6,8).  Lấy vi khuẩn từ thạch nghiêng làm thành dịch huyền phù đậm đặc trong 2 ống, để lại 2 ống làm đối chứng, giữ ở nhiệt độ phòng trong 15-20 phút.  Thêm vào mỗi ống 1 giọt dung dịch FeCl 3 (33%). Nếu hiện màu nâu đỏ là phản ứng dương tính, không đổi màu là âm tính. Có thể dùng vi khuẩn Proteus làm đối chứng dương tính. 3.23. Carboxylaza đối với Ornithin, Lysin, và Arginin  Môi trường: Pepton 5g Cao thịt 5g D-Glucoza 0,5 g Bromocresol purple (BCP) 1,6% 0,625 ml Đỏ Cresol 0,2% 2,5 ml Thạch 3-6 g Nước cất 1000 ml Hòa tan các thành phần trên trong nồi cách thủy, chỉnh đến pH 6, thêm chỉ thị màu.  Chia môi trường thành 4 phần đều nhau, bổ sung từng chất L-Ornithin, L-Lysin, LArginin với nồng độ 1% (nếu dùng DL-acid amin thì lấy nồng độ 2%), sau đó chỉnh pH đến 6,0-6,3. Một phần không thêm acid amin dùng làm đối chứng. Phân vào các ống nghiệm nhỏ (mỗi ống 3-4 ml), khử trùng ở 121 0C trong 10 phút. Môi trường chứa Ornithin có thể tạo một ít kết tủa nhưng không ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm.  Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ), sau đó đổ vaselin bịt kín nút, nuôi ở điều kiện thích hợp. Vi khuẩn đường ruột thuộc họ Enterobacterobacteriaceae cần nuôi ở 37 0 C trong 4 ngày và theo dõi kết quả hàng ngày. Các vi khuẩn phi lâm sàng nuôi ở 30 0 C, quan sát trong 7 ngày. Nếu chỉ thị màu chuyển sang màu tía hay màu tía có ánh đỏ là dương tính, nếu màu vàng (như ống đối chứng) là âm tính. Vi khuẩn đường ruột thường biểu hiện phản ứng dương tính sau 1-2 ngày, nhưng cũng có khi chậm hơn, cần theo dõi qua 3-4 ngày. 3.24. Arginin dihydrolaza  Môi trường Thornley: Pepton 1g NaCl 5g K2HPO4 0,3 g Thạch 6g Đỏ Phenol 0,01 g L-Arginat 10 g Nước cất 1000 ml pH = 7,0-7,2. Phân môi trường vào các ống nghiệm (4-5 ml), khử trùng ở 121 0C trong 15 phút. Chú ý làm ống đối chứng không có Arginat.  Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá, dùng vaselin bịt kín nút ống nghiệm, nuôi ở nhiệt độ thích hợp trong 3, 7, 14 ngày để quan sát. Môi trường chuyển sang màu đỏ là dương tính, không chuyển màu là âm tính. 3.25. Acetylamin  Dung dịch Acetylamin: Acetylamin 2g Nước cất 20 ml (không cần khử trùng)  Dung dịch đệm: K2HPO4 0,4 g KH2PO4 0,1 g KCl 8g Nước cất 1000 ml Khử trùng ở 115 0C trong 20 phút.   Dung dịch làm thí nghiệm: Pha loãng dung dịch Acetylamin trong dung dịch đệm theo tỷ lệ 1:99 vol/vol. Thuốc thử Nessler: KI 5g Nước cất 5 ml Thêm dịch HgCl2 bão hoà, để lạnh cho đến khi lắc mạnh mà vẫn còn một ít kết tủa thì dừng. Thêm 40ml NaOH 9N rồi bổ sung nước đến 100 ml. Lấy 1 vòng que cấy vi khuẩn trộn với dịch thí nghiệm nói trên, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 24 giờ. Thêm 1 giọt thuốc thử Nessler. Phản ứng là dương tính khi tạo kết tủa màu đỏ nâu hay nâu (vi khuẩn Comamonas acidovorans), phản ứng âm tính khi thấy màu vàng (Pseudomonas stutzeri). 3.26. Thompson Thủy phân Hippurat ; Phương pháp Yong & (dùng khi định tên Streptococcus, Campylobacter và Gardnerella vaginalis):  Dung dịch cơ chất: Na-Hippurat Nước cất 0,25 g 25 ml Khử trùng bằng màng lọc  Thuốc thử : Ninhydrin 3,5 g Aceton-butanol (1:1 vol/vol) 100 ml Bảo quản trong lọ tối  Cấy 2 giọt huyền phù vi khuẩn vào dung dich cơ chất, giữ ở 37 0C trong 1 giờ. Thêm 2 giọt thuốc thử, giữ 15 phút.  Phản ứng là dương tính nếu xuất hiện màu đỏ tía (Campylobacter jejuni, Gardnerella vaginlis, Streptococcus agalactiae), phản ứng là âm tính nếu sau 15 phút chưa đổi màu (Campylobacter coli, Streptococcus agalactiae).  Chú ý: lượng vi khuẩn cấy phải thỏa đáng, thời gian ủ trước và sau khi thêm thuốc thử phải chuẩn xác. Tránh ánh sáng khi giữ thuốc thử. Phương pháp Baird-Parker:  Môi trường: Pepton tụy tạng 10 g Cao thịt 1g Glucoza 1g NaH2PO4 5g Na-Hyppurat 10 g Nước cất 1000 ml Phân môi trường vào các ống nghiệm, khử trùng ở 121 0C trong 30 phút.  Thuốc thử: H2SO4 đặc 50 ml Nước cất 50 ml Đổ từ từ H2SO4 đặc vào nước cất  Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ) vào môi trường trên, nuôi ở nhiệt độ thích hợp trong thời gian 4-6 tuần.  Phản ứng xét nghiệm: trộn 1 ml dịch nuôi cấy với 1,5 ml thuốc thử. Phản ứng là dương tính khi xuất hiện tinh thể (do Hyppyrat được chuyển hoá thành Benzoin); không xuất hiện tinh thể là âm tính. 3.27. Hoạt tính ADN-aza Môi trường: 10 g Pepton casein 5g Pepton đậu tương 5g NaCl 2g ADN 0,1 g (có thể pha thành dung dịch rồi cho vào) Toluid-Blue 15 g Thạch 1000 ml Nước cất Hoà tan các thành phần của môi trường bằng nhiệt, sau đó bổ sung ADN và Toluid-blue, trộn đều rồi phân vào bình. Khử trùng ở 121 0C trong 30 phút, đổ thạch đĩa.  Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ) thành điểm trên đĩa thạch, nuôi ở điều kiện thích hợp trong 2 ngày.  Phản ứng là dương tính trong trường hợp quanh cụm cấy có vòng màu đỏ (dùng chủng Salmonella để làm đối chứng dương tính). 3.28. Hoạt tính Phosphataza  Môi trường: Làm nóng chảy môi trường thạch-nước thịt-pepton (đã khử trùng) Thêm 1% Phenolphthalein diphosphat (khử trùng bằng màng lọc). Đổ thạch đĩa.  Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá thành điểm trên thạch đĩa, nuôi ở điều kiện thích hợp trong 2 ngày.  Phản ứng xét nghiệm: lấy 0,1ml nước amonia phủ lên mặt thạch, sau 20 phút xem kết quả. Phản ứng là dương tính nếu khuẩn lạc chuyển màu đỏ phấn (Staphylococcus aureus); không chuyển màu là âm tính. 3.29. Khả năng làm dịch hóa Gelatin  Môi trường: Pepton 5g Gelatin 100-150 g Nước cất 1000 ml pH = 7,2-7,4 Phân môi trường vào các ống nghiệm (4-5 ml), khử trùng ở 115 0C trong 20 phút.  Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ) chích sâu vào môi trường gelatin, giữ 2 ống không cấy làm đối chứng, nuôi ở 20 0C trong thời gian 2,7,10,14,30 ngày.  Quan sát khả năng làm dịch hoá gelatin tại nhiệt độ phòng từ 20 0C trở xuống. Nếu bề mặt môi trường gelatin không lõm xuống, gelatin vẫn ở trạng thái ổn định là phản ứng âm tính (không sinh gelatinaza); nếu một phần hay toàn bộ gelatin hóa lỏng thì là phản ứng dương tính. Nếu so với đối chứng âm tính thấy vi khuẩn đã mọc, gelatin chưa hóa lỏng nhưng bề mặt lõm xuống thì cũng vẫn coi là dương tính (mức độ dịch hóa thấp). Nếu vi khuẩn hoàn toàn không sinh trưởng thì có thể là không mọc được trên gelatin hoặc môi trường cơ sở chưa thích hợp. Chú ý:  - Nếu vi khuẩn chỉ sinh trưởng ở nhiệt độ trên 20 0C, lúc quan sát gelatin hoá lỏng cần đặt ống nuôi cấy một lúc vào nước lạnh rồi so sánh với đối chứng âm tính. - Khử trùng ở nhiệt độ quá cao hay quá thấp đều ảnh hưởng đến kết quả, nên khử trùng ở 115 0C trong 15 phút. - Gelatin chất lượng không đều nhau, lượng dùng khó thống nhất, nên chọn nồng độ tạo đông tốt ở 20 0C là được. Nên dùng thống nhất một loại gelatin cho toàn bộ thí nghiệm. Hình 3.7. Ví dụ minh hoạ kết quả kiểm tra khả năng làm dịch hoá gelatin (sinh gelatinaza), Escherichia coli- âm tính, Pseudomonas aeruginosa- dương tính. 3.30.  Hoạt tính Lipaza (với Tween 80) Môi trường: Pepton NaCl CaCl2. 2H2O 10 g 5g 0,1 g Thạch 9g Nước cất 1000 ml pH = 7,4. Khử trùng ở 121 0C trong 20 phút, để nguội đến 50 0C rồi thêm Tween 80 đến nồng độ 1%, đổ thạch đĩa (có thể thay Tween 80 bằng dầu tributyrin).  Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ) thành vạch, nuôi trong 7 ngày, hàng ngày lấy ra quan sát.  Phản ứng là dương tính nếu quanh vết cấy có vạch trong, nếu không có thì là âm tính. Hình 3.8. Ví dụ minh hoạ kết quả phản ứng thử hoạt tính Lipaza: âm tính - Salmonella typhimurium (bên trái), dương tính - P. aeruginossa (bên phải). 3.31.  Hoạt tính Lipaza (với dầu ngô) Môi trường: Pepton 10 g Cao 3g NaCl 3g Thạch 20 g Xanh Victoria (Victoria Blue) dung dịch 1:5000 trong nước 100 ml Dầu ngô 50 ml Nước cất 900 ml. Hoà tan các thành phần của môi trường (trừ dầu ngô) bằng đun nóng, sau đó bổ sung dầu ngô, khuấy đều bằng máy khuấy từ, chỉnh đến pH 7,8. Phân môi trường vào các ống nghiệm, khử trùng ở 115 0C trong 30 phút. Đặt thạch nghiêng hoặc đổ thạch đĩa, môi trường có màu đỏ nhạt.  Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ), nuôi ở nhiệt độ thích hợp trong 24 giờ.  Quan sát: phản ứng là dương tính khi môi trường chuyển sang màu lam, không chuyển màu là âm tính. Hình 3.9. 3.32. Ví dụ minh hoạ kết quả phản ứng thử hoạt tính lipaza với dầu ngô. Hoạt tính Lecithinaza  Trộn lòng đỏ trứng với cùng trọng lượng nước muối sinh lý (thao tác vô trùng) tạo thành dịch huyền phù.  Lấy ra 10 ml dịch huyền phù trên hòa tan vào môi trường thạch-nước thịt-pepton vừa khử trùng, để nguội đến 50-55 0C rồi đổ đĩa Petri.  Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ) thành điểm trên đĩa thạch, mỗi điểm đường kính khoảng 2-3mm. Cấy 5-7 chủng trên một đĩa. Với vi khuẩn kỵ khí có thể đậy lá kính mỏng (lamelle) lên vết cấy, tuy nhiên tốt nhất là đưa vào tủ nuôi kỵ khí.  Đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 18-24 giờ, một số chủng (như chi Bacillus) cần thời gian lâu hơn (48 giờ) và quan sát biến đổi của môi trường thạch.  Nếu xung quang và dưới vết cấy có vạch trong là phản ứng dương tính (Lecithin được chuyển hoá thành lipid do vi khuẩn sinh men lecithinaza).  Chú ý: khi trộn dịch huyền phù lòng đỏ trứng vào môi trường thạch không nên tiến hành ở nhiệt độ quá cao vì sẽ làm ngưng kết lecithin có trong lòng đỏ trứng. Hình 3.10. Khả năng phân hủy Lecithin của Clostridium 3.33. Khả năng sản sinh H2S Phương pháp giải giấy  Môi trường: Pepton 10 g NaCl 5g Cao thịt 10 g Cystein 0,5 g Nước cất 1000 ml pH = 7,0-7,4 Phân môi trường vào các ống nghiệm (4-5 ml), khử trùng ở 112 0C trong 20-30 phút.  Cắt giấy lọc thành dải rộng 0,5-1cm, độ dài tùy thuộc vào ống nghiệm và độ cao của môi trường. Tẩm vào giấy dung dịch Chì-acetat, sấy khô giấy trong tủ sấy đặt trong hộp Petri và khử trùng.  Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ). Dùng panh vô khuẩn gắp giấy tẩm chì-acetat đưa vào từng ống nghiệm, dài đến nút bông nhưng không chạm vào môi trường. Nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ thích hợp, sau 3,7,14 ngày thì lấy ra quan sát. Nếu giấy biến đen là phản ứng dương tính, nếu không đổi mầu thì là âm tính.  Chú ý: phương pháp này rất mẫn cảm, không thích hợp đối với trực khuẩn đường ruột. Không đặt giấy lọc tẩm chì-acetat gần mặt môi trường quá để tránh bị hút ẩm, nhưng cũng không nên đặt cách xa quá. Ngoài ống đối chứng không cấy vi khuẩn nên lấy chủng vi khuẩn đã biết là âm tính để làm đối chứng. Phương pháp đối với Trực khuẩn đường ruột  Môi trường: Cao thịt 7,5 g Pepton 10 g NaCl 5g Gelatin 100-120 g (hay thạch Dung dịch FeCl2 10% Nước cất 15 g) 5 ml (khử trùng riêng bằng màng lọc) 1000 ml pH = 7,0 Khử trùng ở 112 0C trong 20 phút, bổ sung dung dịch FeCl 2 (đã khử trùng) vào khi thạch hay gelatin chưa đông. Phân vào các ống nghiệm vô khuẩn (4-5 ml), ngay lập tức nhúng vào nước lạnh cho đông lại.  Cấy chích sâu vi khuẩn vào các ống, nuôi ở 30 0C trong 1,3,7 ngày. Nếu môi trường chuyển thành màu đen là phản ứng dương tính, nếu không đổi mầu là âm tính.  Chú ý: phương pháp này dùng khi cần định tên vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae. Có thể dùng FeSO4 thay thế cho FeCl2. Nếu nuôi cấy ở 20 0C có thể dùng kết hợp để xác định gelatinaza. 3.34. Khả năng phân giải sữa (Litmus Milk Reaction)   Môi trường: sữa tươi đun sôi, để lạnh qua đêm, ly tâm và hớt bỏ bơ ở lớp trên, phần dưới là sữa không chứa lipid. Có thể dùng sữa bột đã loại chất béo (hoà tan 100 g sữa bột với 1000 ml nước). Thuốc thử Litmus: hoà tan 2,5 g Litmus trong 100 ml nước cất, lọc bằng giấy lọc, để qua đêm mới sử dụng. Có thể bảo quản lâu.  Môi trường sữa –Litmus: Dung dịch Litmus 2,5% Sữa đã loại bơ Môi trường có màu đỏ tía. 4 ml 1000 ml Phân môi trường vào các ống nghiệm (4 ml), khử trùng gián đoạn hay khử trùng ở 112 0C trong 20-30 phút.   Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ), nuôi ở nhiệt độ thích hợp, sau 1,3,5,7,14 ngày lấy ra quan sát. Dựa vào biến đổi của môi trường mà có những kết luận như sau: Môi trường chuyển thành màu trắng  phản ứng khử Litmus Môi trường trở nên trong  phản ứng peptôn hoá Môi trường chuyển mầu đỏ  phản ứng sinh acid Môi trường chuyển màu xanh lam  phản ứng sinh kiềm Môi trường chuyển màu đỏ, sữa ngưng kết  sinh acid và ngưng kết Ngưng kết do men: không chuyển màu hoặc có màu lam, sữa vón cục và ngưng kết  3.35.  Chú ý: tốt nhất nên dùng sữa tươi, không cần điều chỉnh pH. Khả năng oxy hóa Gluconat Đệm Kali phosphat 1/15 mol/L, pH 7,2: A) KH2PO4 9,078 g/L B) K2HPO4.12H2O 23,876g/L Trộn 3 ml dung dịch A với 7 ml dung dịch B để có dung dịch đệm phosphat 1/15 mol/L, pH 7,2  Thuốc thử Feling: Dung dịch A: CuSO4 tinh thể Nước cất Dung dịch B: Na-Tartrat 34,64 g thêm tới 500 ml 173 g KOH 125 g Nước cất thêm tới 500 ml Trước khi dùng trộn hai dung dịch A và B theo tỷ lệ 1:1 (vol/vol), sử dụng trong ngày.  Chuẩn bị dung dịch gluconat 1% trong đệm phosphat pH 7,2, phân vào các ống nghiệm, mỗi ống 2ml. Khử trùng 112 0C trong 30 phút.  Lấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ) để tạo dịch huyền phù đậm đặc trong đệm phosphat, giữ ở 30 0C qua đêm.  Thêm vào mỗi ống 0,5 ml thuốc thử Feling, đặt trong bình cách thủy sôi 10 phút.  Kết quả: nếu dịch huyền phù chuyển từ màu lam sang màu vàng lục, lục da cam hoặc có kết tủa đỏ là phản ứng dương tính; nếu không đổi màu là âm tính.  Chú ý: nếu dùng gluconat canxi thì dễ tạo kết tủa với gốc phosphat, tuy nhiên không ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm. 3.36.  Khả năng oxy hóa Etanol Với vi khuẩn Acetobacter dùng môi trường sau: Cao men 10 g Nước máy 1000 ml Xanh Bromophenol (BPB) 0,04% 20 ml. pH = 6,8-7,0 Phân môi trường vào các ống nghiệm (4-5 ml), khử trùng ở 121 0C trong 20 phút. Lúc sử dụng thêm ethanol vào mỗi ống ở nồng độ khoảng 2-10% (vol/vol)    Với các vi khuẩn khác: dùng môi trường như trong thí nghiệm oxy hóa/lên men, thay đường bằng etanol với nồng độ 1%. Có thể không cần thạch. Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá, nuôi 1,3,7,14 ngày trong điều kiện thích hợp Kết quả: nếu môi trường chuyển màu vàng (do sinh acid) thì là dương tính, không đổi màu là âm tính. Phương pháp khác (dùng để phân lập và kiểm định Acetobacter):    Thêm vào các môi trường nói trên 2% thạch và 1% CaCO 3; nồng độ etanol cuối cùng là 2%; không thêm chỉ thị màu. Đổ thạch đĩa. Cấy vi khuẩn trên thạch đĩa, nuôi 3, 7, 14 ngày ở điều kiện thích hợp. Kết quả: nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng phân giải trong là kết quả dương tính, nếu không là âm tính (Acetobacter lúc đầu phân giải CaCO3 nên tạo vòng trong, nhưng sau đó acetat canxi tạo ra bị oxy hóa tiếp chuyển thành CaCO 3 vòng trong chuyển màu trắng sữa sáng do acid acetic đã bị oxy hóa). 3.37. Khả năng oxy hóa acid acetic  Môi trường: Cao men 10 g Ca-Acetat 10 g Thạch 20 g Nước máy 1000 ml pH 7,0-7,2 Phân môi trường vào bình tam giác hoặc các ống nghiệm lớn để khử trùng, đổ thạch đĩa hoặc làm ống thạch nghiêng.   Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ), nuôi 3-5 ngày ở điều kiện thích hợp Kết quả: nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng trắng sữa là phản ứng dương tính (acetat đã bị oxy hóa, canxi giải phóng ra tạo màu trắng sữa), nếu không thì là âm tính. 3.38.  Xác định Indol-Pyruvic acid (IPA) Môi trường SIM: Cao thịt 3g Pepton 30 g Na2S2O3.5H2O 0,05 g Cystin hydrochlorid Ammonium-ferric-citrat 0,2 g 0,5 g Thạch 4g Nước cất 1000 ml Hoà tan các thành phần môi trường trong nồi cách thủy, chỉnh pH đến 7,4, phân vào các ống nghiệm nhỏ, khử trùng ở 121 0C trong 15 phút, đặt ống thạch đứng.  Thuốc thử Kovac (có thể mua sẵn hoặc tự pha): p-dimethyl aminobenzaldehyd 8g Etanol 760 ml HCl đặc 160 ml  Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ) vào môi trường SIM, nuôi ở 300C trong 24 giờ.  Kết quả: nếu phần trên của môi trường chuyển màu nâu là phản ứng IPA dương tính, nếu không là phản ứng âm tính.  Sau đó nhỏ thêm thuốc thử Kovac vào và quan sát. Nếu trên mặt thạch xuất hiện màu đỏ đào là phản ứng Indol dương tính. Hình 3.11. Ví dụ minh hoạ phản ứng Indol dương tính. Tài liệu tham khảo : 1. James G. Cappuccino & Natalie Sherman, 2002. Microbiology: a Laboratory Manual, 6th ed. Pearson Education, Inc., Sanfransisco, CA. 2. Hans Trueper & Karl-Heinz Schleifer, 2000. Prokaryote Characterization and Identification. In: Dworkin W., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.-H. & Stackebrandt E. (ed.). The Prokaryotes: an Evolving electronic resource for the microbiological community. Springer-Verlag, New York. 3. Vũ Thị Minh Đức, 1998. Thực tập Vi sinh vật. NXB GD, ĐHTH Hà Nội. 4. Krieg N.R. & Holt J.G. (ed.) 1984. Bergey’s manual of systematic bacteriology. Williams & Wilkins, Baltimore, USA. 5. Đông Tú Châu et al.,2001, Thường kiến tế khuẩn hệ thống giám định thủ sách, Khoa học xuất bản xã (Trung văn).